Nat Commun | 齐鑫课题组揭示化合物CHIR99021通过调节线粒体功能来治疗亨廷顿氏舞蹈病的分子机制

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撰文︱胡迪（Di Hu）

责编︱王思珍

线粒体（mitochondria），是负责合成ATP的重要细胞器。在神经元内，线粒体负责脂代谢调控（lipid metabolism）、钙离子缓冲（Ca²⁺ buffering）  、氧化还原调控（redox regulation）【1】。因此线粒体直接影响神经元的功能，而线粒体功能紊乱会导致神经元死亡【1】。在多种神经退行性疾病中（neurodegenerative diseases），线粒体功能紊乱（mitochondrial dysfunction）已被广泛视为神经元死亡的重要原因 【2】。 因此增强和调节线粒体功能或能成为神经退行性疾病的有效治疗手段。

亨廷顿氏舞蹈症（Huntington’s disease，HD）是一种遗传性的恶性神经退行性疾病，其典型神经病理学特征包括在大脑纹状体区域内的中性多棘神经元的死亡（medium spiny neuronal death）以及突变亨廷顿蛋白的聚集（mutant huntingtin（mtHtt） aggregation）【3】。 罹患此症的病人早期会出现情绪及智力方面的问题，随后出现运动不协调，随着运动能力逐渐恶化造成运动困难，严重者最后死亡【3】。HD目前无法治愈，已有的治疗方法只能延缓病情发展。由于mtHtt能够损伤神经元里的多种分子以及细胞功能，HD的新靶点发掘以及药物研发变得困难重重【4】。近期研究阐明线粒体功能紊乱在HD病理机制中起关键性作用。

2021年9月6日，美国凯斯西储大学医学院（Case Western Reserve University School of Medicine）的齐鑫（Xin Qi）课题组与Drew Adams课题组合作在Nature Communications上在线发表了题为“Small-molecule suppression of calpastatin degradation reduces neuropathology in models of Huntington’s disease”的研究论文，揭示了增强线粒体功能是HD的一种潜在治疗方法的重要机制。胡迪（Di Hu）为该论文的第一作者。在此项研究中，作者以线粒体功能为靶点通过高通量筛选找到小分子化合物 CHIR99021，并在多种细胞和动物模型中验证了它的治疗效果。作者阐明了该化合物调节线粒体功能的信号通路。此研究促进了对HD病机理的认识以及相应的药物研发。

在HD小鼠派生的纹状体神经细胞（HdhQ111 cell）里，CHIR99021处理可以显著增强线粒体膜电势（mitochondrial membrane potential），提高细胞存活（cell viability），并有效增强线粒体呼吸（mitochondrial respiration）。在HD病人诱导性多功能干细胞（iPSC）分化的中性多棘神经元里，CHIR99021处理也有效增强了线粒体功能并显著改善神经元形态。这些结果表明CHIR99021对受HD影响的神经元具有保护作用。接下来，作者利用R6/2（急性转基因模型）和YAC128（慢性转基因模型）两种HD小鼠模型来验证CHIR99021的保护性。通过长期腹腔注射（intraperitoneal injection） CHIR99021，作者观察到R6/2 HD小鼠的存活显著提高，纹状体区域内mtHtt蛋白聚集显著减少，中性多棘神经元的数量显著增多。长期注射CHIR99021同样显著减轻YAC128 HD小鼠的神经病理特征。除此之外，CHIR99021处理也显著改善小鼠的自发活动能力和运动协调能力。这些结果进一步证明了CHIR99021能有效保护神经元并且缓解HD病理发展。同时，CHIR99021注射对于正常小鼠没有明显副作用。

进一步地，在通过一些列实验排除糖原合成酶激酶3（GSK3）为CHIR99021的分子靶点之后，作者利用蛋白组学分析法发现，在HdhQ111细胞内CHIR99021处理下调钙蛋白酶I型（Calpain I）的表达并上调钙蛋白酶抑素（Calpastatin，CAST）的表达。已知CAST是Calpain I的内源特异性抑制剂【5】。在许多神经退行性疾病中，Calpain I的过度激活与神经损伤有重要关联【6】。由此，作者假设CHIR99021通过调节CAST-Calpain I分子通路来保护线粒体功能。在多种细胞、小鼠模型以及HD病人脑组织里，作者观察到CAST的蛋白水平一致降低，并且Calpain I的酶切底物α-Spectrin的蛋白切割水平显著升高。然而作者并没有检测到CHIR99021对Calpain I酶活性的直接影响，由此说明CHIR99021是通过上调CAST蛋白水平来间接抑制Calpain I。在HdhQ111细胞和HD iPSC分化的神经元内，CAST蛋白敲低使CHIR99021处理不再增强线粒体膜电势和细胞存活，证明了CHIR99021提供的线粒体保护依赖于CAST蛋白。作者还进一步发现在HD细胞内，CAST蛋白的降解速率以及泛素化水平显著升高。CHIR99021处理使CAST蛋白的泛素化水平大幅度降低，从而蛋白水平恢复到正常水平。由此可见，CHIR99021通过抑制CAST降解来稳固CAST蛋白水平，换言之，CHIR99021治疗可以抑制HD中CAST的泛素-溶酶体蛋白降解途径。

最后，作者发现CHIR99021能够通过调节发动蛋白（dynamin）相关蛋白Drp1的活性来抑制线粒体分裂从而恢复线粒体形态。Drp1的磷酸化会促使线粒体过度分裂，导致线粒体碎片化（mitochondrial fragmentation）、呼吸抑制、以及膜电势降低。作者检测了一系列线粒体质量调控相关的蛋白的表达，发现在HD细胞里磷酸化Drp1的蛋白水平显著升高，而CHIR99021处理使其降低到正常水平。除此之外，在HD小鼠模型里，作者也观察到CHIR99021处理使得Drp1磷酸化水平显著降低。这说明CHIR99021通过调节Drp1蛋白活性来调控线粒体形态及功能。同样，CAST蛋白敲低使CHIR99021处理不再调节线粒体形态，这进一步证明了CHIR99021的线粒体保护作用依赖于CAST蛋白。

图1 工作总结图：CHIR99021调节线粒体功能的机制

（图片引自：Hu et al., Nat Comm 2021; 12: 5305）

文章结论与讨论，启发与展望

作者通过研究CHIR99021增强线粒体功能的机制发现了CAST-Drp1作为调节线粒体功能的信号通路（图1）。CAST蛋白水平降低引起Drp1磷酸化并导致线粒体破碎化和线粒体功能紊乱。CHIR99021处理能够有效抑制CAST蛋白的泛素化以及降解从而抑制线粒体分裂，恢复线粒体形态。长期注射CHIR99021显著缓解HD小鼠的神经病理特征并改善运动行为能力。这说明增强线粒体功能能有效缓解HD病理发展。因此CHIR99021也许是一种潜在的HD治疗药物。

另外此研究也提示，除了HD，在其他神经衰退性疾病中，例如帕金森病和阿尔兹海默综合征，Calpain I过度激活导致的神经损伤也已被反复证明。因此，CAST可作为通用的靶点蛋白，而CHIR99021也许能够被广泛运用。 

当然，这项研究还存在一些尚未解决的问题。比如，尽管CHIR99021可以抑制CAST的泛素化及降解，然而，相对应的调控分子还未被发现，其中可能性包括特异的泛激素或者去泛素化酶。其次，虽然CHIR99021不通过抑制GSK3来调节线粒体功能，但GSK3依旧是CHIR99021的一个重要靶点蛋白，因此开发能选择性增强CAST活性的CHIR99021衍生物或化学修饰小分子是很有必要的。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-25651-y

齐鑫（Xin Qi） 教授课题组致力于研究线粒体的质量控制与代谢在神经衰退性疾病中作用。课题组利用细胞生物，分子生物，干细胞培养，动物模型等相关的实验技术对神经疾病的病理机制进行全面剖析，并通过高通量筛选小分子化合物和自行设计并合成特异性多肽来研发以线粒体为靶点的治疗方法。课题组正在招募博士后和研究人员， 有意者请联系。 

Postdoc positions are available in the Xin Qi lab at Case Western Reserve University School of Medicine. The successful applicants will participate in NIH-funded projects on elucidating the molecular basis of metabolic dysregulation and immune response in neurodegenerative diseases. The applicants must have a PhD and/or MD degree in neuroscience, molecular biology, cell biology, pharmacology, or related field.Interested individuals should send a cover letter, CV, and the names/phone numbers of three people who could provide letters of reference by email to Xin Qi, PhD, [e-mail].  Please visit our lab website at https://www.xinqi-lab.com for additional information.

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参考文献（上下滑动查看）  

【1】Misgeld, T. and T.L. Schwarz, Mitostasis in Neurons: Maintaining Mitochondria in an Extended Cellular Architecture. Neuron, 2017. 96(3): p. 651-666.

【2】Lin, M.T. and M.F. Beal, Mitochondrial dysfunction and oxidative stress in neurodegenerative diseases. Nature, 2006. 443(7113): p. 787-95.

【3】Roos, R.A., Huntington's disease: a clinical review. Orphanet J Rare Dis, 2010. 5: p. 40.

【4】McColgan, P. and S.J. Tabrizi, Huntington's disease: a clinical review. Eur J Neurol, 2018. 25(1): p. 24-34.

【5】Hanna, R.A., R.L. Campbell, and P.L. Davies, Calcium-bound structure of calpain and its mechanism of inhibition by calpastatin. Nature, 2008. 456(7220): p. 409-12.

【6】Vosler, P.S., C.S. Brennan, and J. Chen, Calpain-mediated signaling mechanisms in neuronal injury and neurodegeneration. Mol Neurobiol, 2008. 38(1): p. 78-100.

制版︱王思珍

本文完