Nat Commun︱首次！人眼睛眼球玻璃体中转甲状腺素蛋白扭曲二聚体的结构解析
撰文︱孙 勋
责编︱王思珍
淀粉样蛋白是由高度有序的富含β片层结构的蛋白质自组装聚集形成的直径为100-200 Å的纤维。淀粉样蛋白在不同组织中的积累会导致不同的淀粉样蛋白病。人血浆蛋白转甲状腺素蛋白（transthyretin，TTR）是已知的30多种引起淀粉样变性的蛋白质之一[1-3]。TTR主要产生于肝脏[4]，是甲状腺素激素和维生素A的转运体[5,6]。淀粉样TTR（ATTR）的细胞外沉积与ATTR淀粉样变性有关。遗传性ATTR淀粉样变性由TTR单点突变引起，目前已知有100多个致病性单点突变[7]。其中，第30位点的缬氨酸→蛋氨酸的突变，即Val30Met，是ATTR最常见的单点突变。ATTR的淀粉样沉积主要发生在周围神经、肾脏、脾脏、眼睛和心脏中，其眼部病变包括玻璃体中淀粉样蛋白的沉积[8]。但人们对玻璃体中淀粉样蛋白纤维的结构尚不清楚。
TTR纤维形成遵循下坡聚合机理[9]。在其天然功能状态下，TTR形成同源四聚体，其中央通道的两侧含有甲状腺激素结合位点[10]。每个亚基包括一个八股β-桶和一个α螺旋。四聚体分解成单体是TTR纤维生成的限速步骤。而且单体的CD环易于水解，产生潜在的纤维蛋白源性N端和C端片段[11-14]。主要的蛋白裂解位点位于残基Lys48和Thr49之间，但在残基Ala45-Glu54内也存在蛋白裂解位点[15]。然而，人们对TTR蛋白水解是发生在纤维形成之前还是之后，尚不清楚。多态性是淀粉样纤维的一个常见特征，描述了由相同蛋白质形成的不同形态结构[16]。目前还不清楚多态性是如何发生的，以及在不同器官中形成的纤维之间的差异。眼球玻璃体中也有ATTR淀粉样纤维，玻璃体ATTR的合成有其自身的局部来源，比如视网膜色素上皮，这意味着玻璃体淀粉样变性可能有不同的错误折叠和聚集途径[17,18]。因此，有必要对玻璃体中的淀粉样纤维进行结构表征，并与其他器官的淀粉样纤维进行结构比较。
2021年12月，来自瑞典于默奥大学化学系的Irina Iakovleva（第一作者并共同通讯作者）、Elisabeth Sauer-Eriksson（通讯作者）等人在Nature Communications上发表了题为“Structural basis for transthyretin amyloid formation in vitreous body of the eye”的最新研究论文，对ATTR淀粉样病变患者眼球玻璃体的淀粉样纤维进行了结构表征，表明了玻璃体内的ATTR纤维具有多态性，且主要由原纤维丝组成，确定了空间分辨率为3.2 Å的扭曲二聚体的结构，并与心脏的单原纤维丝结构进行比较，提出了ATTR淀粉样纤维形成的可能分子机制。
首先，作者从ATTR Val30Met患者眼球的玻璃体中离心分离淀粉样蛋白纤维，通过冷冻电镜技术（cryo-EM）分析纤维的形态。结果显示有三种不同类型的纤维：单纤维（~23%）；扭曲二聚体（~62%）和扭曲三聚体（~13%）（图1a）。通过测量单纤维、扭曲二聚体和扭曲三聚体的交叉距离和最大宽度，表征了不同纤维的形态特征。对于单体，交叉距离在130-160 nm之间，对于扭曲二聚体，交叉距离为130-170 nm，对于扭曲三聚体，交叉距离为140-190 nm（图1b）。纤维的宽度和纤维丝的数量有关，单纤维宽度约为7.5nm，扭曲二聚体的宽度约为两条单纤维丝，扭曲三聚体的宽度约为三条单纤维丝（图1b）。以上结果表明，玻璃体淀粉样纤维是通过不同多态性的纤维丝并列缠绕形成的。
图1 玻璃体中ATTR纤维的Cryo-EM成像和分析
（图源：Irina Iakovleva. et al., Nat Commun, 2021）
利用cryo-EM，作者获得了空间分辨率为3.2 Å的由两条缠绕的原纤维丝组成的扭曲二聚体的结构。每条原纤维丝蛋白都具有相同的构象，其沿长轴具有双重对称轴（即C2对称），一条原纤维丝内的蛋白层与另一条原纤维丝内的蛋白层堆叠在一起（图2a）。原纤维丝沿着C2轴缠绕成左旋螺旋，螺旋交叉距离为154nm，螺旋扭曲度为–0.55°，螺旋上升4.72 Å。原纤维丝的N端包含残基Pro11-Lys35，C端包含残基Gly57-Thr123（图2b,c），N端和C端形成了连续库伦电位区域。
图2 玻璃体中ATTR扭曲二聚体的Cryo-EM重建
（图源：Irina Iakovleva. et al., Nat Commun, 2021）
可溶性TTR以同源四聚体形式存在，其中每个单体中的127个氨基酸折叠成由两个β-片层形成的β-桶状结构，而扭曲二聚体中的每条纤维丝蛋白有11条β-链（β1-β11）。这些β链的位置与天然折叠蛋白质中β链的位置并不一致（图3a）。在扭曲二聚体中，由于TTR中的α-螺旋的重排，使得3D桶体结构转换为几乎平坦的盘状结构，盘状结构堆叠形成原纤维丝。接着，作者比较了玻璃体中扭曲二聚体和心脏ATTR淀粉样纤维的结构。心脏ATTR纤维是由单条原纤维丝组成，而玻璃体中ATTR纤维主要为扭曲二聚体。玻璃体和心脏纤维蛋白的盘状结构由ATTR的N-末端和C-末端片段组成，包括残基Pro11–Lys35和Gly57-Thr123（图3b,c）。玻璃体纤维蛋白包含11条β-链，而心脏纤维蛋白包含13条β-链。两种纤维蛋白主要的结构区别是C-末端片段的前11个残基Gly57-Ile68。在玻璃体纤维蛋白中，这些氨基酸残基形成一条长的β-链，位于纤维蛋白的核心之上；在心脏纤维蛋白中，这些氨基酸残基形成两条短的β-链，呈L形，呈现出空腔结构（图3c）。纤维蛋白质的不同构象极大地影响了表面的电荷分布（图3f）。以上结果显示，玻璃体中的ATTR淀粉样纤维与心脏中的并不完全相同。
图3 玻璃体和心脏中ATTR纤维的二级结构
（图源：Irina Iakovleva. et al., Nat Commun, 2021）
扭曲二聚体中的原纤维丝通过交叉氢键连接在一起。原纤维丝中His90位点的侧链咪唑环通过氢键与另一条原纤维丝中的Glu92位点的侧链羧基相连（图4a）。一部分咪唑环在pH为7.0–7.2时带正电荷，这有助于接口处的交互连接。接着，作者将扭曲二聚体与其他三种高分辨率的淀粉样纤维的结构进行了比较，虽然蛋白序列不同，但原纤维丝的相互作用相似（图4b）。所有的纤维在蛋白质链的急转弯处，原纤维丝间的氨基酸残基会相互作用，以盐桥或氢键形成静电相互作用，在相对较小的界面上稳定相互作用（图4）。
图4 原纤维丝的相互作用
（图源：Irina Iakovleva. et al., Nat Commun, 2021）
图5 ATTR纤维形成的可能分子机制
（图源：Irina Iakovleva. et al., Nat Commun, 2021）
作者对玻璃体中扭曲二聚体与心脏单原纤维丝的cryo-EM结构进行了比较。两种纤维都包括长度相同的N端和C端片段，但C-末端片段的前11个残基的构象不同，在心脏单原纤维丝中呈现出空腔结构。玻璃体原纤维丝包含11条β-链，而心脏原纤维丝包含13条β-链。因此，作者提出了TTR蛋白在淀粉样原丝形成过程中如何展开和错误折叠的可能机制，TTR蛋白的重新折叠可能是通过与另一个部分折叠的TTR分子的相互作用来形成的（图5）。总之，高分辨率的ATTR淀粉样纤维结构解析有助于开发抗ATTR淀粉样蛋白的新疗法。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-021-27481-4
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参考文献（上下滑动阅读）
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制版︱王思珍
本文完