Mol Psychiatry︱叶克强课题组揭示炎症激活的C/EBPβ/AEP信号通路介导高脂饮食诱发的糖尿病及阿尔兹海默症
撰文︱叶克强，王蒙蒙
责编︱王思珍
制版︱查佳雪
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease，AD）是一种进行性神经退行性疾病，以痴呆为最突出的临床症状，其关键的神经病理学特征包括沉积在老年斑中的细胞外淀粉样蛋白-β（Aβ）积累和神经元内过度磷酸化和截短的Tau 聚集成神经原纤维缠结（NFT），与神经炎症和广泛的神经元丢失有关。慢性炎症在AD发病中起关键作用[1,2]。二型糖尿病（type 2 diabetes，T2DM）表现为高血糖、胰岛素抵抗和外周炎症，是AD的风险因素[3]。研究表明，T2DM患者出现轻度认知障碍、痴呆或AD的风险增加，AD患者表现出进行性脑胰岛素抵抗和胰岛素缺乏。因此，AD也被称为3型糖尿病，但相关分子机制尚不完全清楚[4, 5]。
C/EBPβ是一种炎性细胞因子激活的转录因子，能够被多种炎症因子激活，如IL-6、IL-1β、TNF-α及LPS [6]。C/EBPβ在暴露于高葡萄糖浓度的β细胞系以及糖尿病动物的胰岛中增加[7]，并抑制β细胞系中的胰岛素mRNA的转录。天冬酰胺内肽酶（asparagine endopeptidase，AEP）是一种酸性激活的半胱氨酸蛋白酶，在人脑中随年龄增长和激活，作为δ-分泌酶通过剪切APP和Tau加速Aβ的产生和Tau的聚集促进AD的发病[8, 9]。C/EBPβ以年龄依赖性方式调节中枢神经神经元中AEP的表达，敲除C/EBPβ可通过减少AEP的表达减轻AD病理[10]。
由于C/EBPβ与介导胰岛素和胰岛素抵抗（IR）表达有关，因此C/EBPβ敲除小鼠对HFD诱导的肥胖具有抵抗作用[11]。越来越多的证据支持炎症在糖尿病和AD病理学之间起关键作用的观点[12-13]。因此，本文研究者猜想神经元中的C/EBPβ可能通过调节大脑和外围系统中的胰岛素信号传导，将糖尿病与AD耦合。
2022年5月11日，埃默里大学的叶克强课题组在《分子精神病学》（Molecular Psychiatry）上发表了题为“High-fat diet-induced diabetes couples to Alzheimer’s disease through inflammation-activated C/EBPβ/AEP pathway”的研究论文，提出C/EBPβ/AEP是高脂饮食诱发的T2DM和AD的共同机制。刘派为论文第一作者，叶克强教授为论文通讯作者。在此项研究中，作者发现，高脂饮食引起的肥胖和糖尿病相关的炎症，激活了神经元中的C/EBPβ/AEP信号通路。高脂饮食刺激了神经元Thy1-C/EBPβ转基因小鼠的糖尿病和胰岛素抵抗，伴随着显著的小鼠大脑中Aβ的积累和过度磷酸化的Tau聚集，引发认知缺陷。当从C/EBPβ Tg小鼠中敲除AEP时，这些影响会大大减弱。与野生型小鼠相比，炎症性脂多糖促进了C/EBPβ Tg小鼠的AD病理和认知障碍，而这些有害影响在C/EBPβ Tg/AEP-/-小鼠中得到显著缓解。值得注意的是，抗炎药阿司匹林可有效减轻神经元C/EBPβ Tg小鼠中HFD诱导的糖尿病和AD病变。因此该文研究结果表明，炎症激活的神经元C/EBPβ/AEP信号介导了糖尿病诱发的AD。（拓展阅读：叶克强课题组最新进展，详见“逻辑神经科学”报道：Mol Psychiatry︱叶克强课题组揭示C/EBPβ/AEP信号通路介导了动脉粥样硬化及其诱发的阿尔兹海默症）
为了探索神经元C/EBPβ随着年龄增加而升高是否促进糖尿病和AD病理学，作者开发了一种神经元特异性Thy1启动子介导的人C/EBPβ转基因小鼠（Thy1-C/EBPβ Tg）。单或双C/EBPβ Tg小鼠存活且可生育。使用“WT”表示Thy1-C/EBPβ转基因小鼠的非转基因同窝仔，“C/EBPβTg”表示携带单拷贝人类CEBPβ基因的半合子转基因小鼠，“C/EBPβTg /Tg”用于携带两个基因拷贝的纯合转基因小鼠。为了在这些小鼠中诱导T2DM，连续12周采用高脂饮食（HFD）处理，发现C/EBPβ Tg小鼠C/EBPβ水平和磷酸化信号升高，且神经元C/EBPβ升高在大脑中触发胰岛素抵抗。
由于C/EBPβ在糖尿病和AD中都起着至关重要的作用，并且其关键的下游靶标AEP在驱动AD发病过程中切割APP和Tau，作者将AEP -/-小鼠与Thy1-C/ EBPβ Tg小鼠杂交以获得Thy1-C/EBPβ/AEP -/-小鼠。无论HFD或普通膳食，C/EBPβ/AEP -/-小鼠的体重没有显著差异（图1 A），并表现出高胰岛素敏感性（图1 B），且HFD处理引起的葡萄糖不耐受显著高于普通饮食（图1 C-E）。在喂食HFD后，C/EBPβ/AEP -/-小鼠胰岛素水平高于进食和禁食条件下的食物组（图1 F,G）。HFD喂养增加了所有受试小鼠的循环瘦素浓度，在WT动物中发现的瘦素水平最高，其次是C/EBPβ/AEP -/-和C/EBPβ Tg小鼠（图1 H）。同样，HFD喂养小鼠大脑中的胰岛素水平比其相应的食物控制更丰富，但WT小鼠的胰岛素浓度显著高于C/EBPβ。因此，高脂饮食可诱导Thy1-C/EBPβ转基因小鼠糖尿病的发生，而AEP的敲除可缓解糖尿病的发生。
（图源：P Liu et al., Mol Psychiatry, 2022）
脂肪细胞功能障碍是引发胰岛素抵抗的主要因素之一。因此，该研究检查了C/EBPβ Tg小鼠中饮食诱导的脂肪生成。HFD强烈增加Thy1-C/EBPβ Tg小鼠的脂质沉积、脂肪细胞大小和炎症，而AEP的敲除显著降低了这些影响。AMPK（AMP活化蛋白激酶）是一种燃料感应激酶。AMPK的激活降低了肝糖异生基因的表达和葡萄糖的产生，增加了脂肪酸的氧化，并增强了葡萄糖的摄取[14]。C/EBPβ Tg小鼠中p-AMPK和p-ACC明显降低，而敲除AEP减轻了这种抑制（图2 A）。在BAT、肌肉和肝脏中也观察到类似的效果（图2 B-D）。因此，AMPK/ACC信号在C/EBPβ Tg小鼠的外周组织中减少，AEP的缺失减轻了C/EBPβ/AEP -/- Tg小鼠的这种抑制作用。此外，作者监测了包括肌肉和肝脏在内的胰岛素反应组织中的胰岛素信号传导，C/EBPβTg小鼠肌肉中的p-IR明显降低，敲除AEP显著消除了这种效应（图2 E）。因此，在基础条件下，Thy1-C/EBPβTg小鼠的胰岛素信号传导和 p-AMPK/p-ACC 通路均受损，而HFD治疗进一步抑制了这种代谢信号传导。
（图源：P Liu et al., Mol Psychiatry, 2022）
为了评估神经元C/EBPβ或HFD对大脑中胰岛素信号传导的影响，作者在大脑中检测到类似的P-AMPK/p-ACC通路模式（图3 A,B）。酶促分析显示，HFD可增加WT小鼠脑中的AEP蛋白酶活性，在C/EBPβ Tg小鼠中，从食物饮食到HFD进一步增强，并且它们在C/EBPβ/AEP -/-小鼠中被根除（图3 C）。促炎细胞因子包括IL-1β和IL6，但不包括TNFα，显示出相似的模式（图3 D-F）。同时发现C/EBPβ和截短（活性）AEP在HFD处理后在WT小鼠中升高，在C/EBPβ Tg小鼠的大脑中增强，并通过HFD刺激进一步升高，伴随着片段化的APP N585和Tau N368截断增加。因此，在HFD治疗后，C/EBPβ Tg小鼠的p-Tau AT8水平显著增加。值得注意的是，通过HFD刺激，C/EBPβTg小鼠的Tau5和BACE1总水平均得到增强（图3 G），且HFD通过C/EBPβ/AEP信号传导通过活性AEP刺激APP N585和Tau N368切割的产生。与这些发现一致，HFD显著增加了C/EBPβTg小鼠中Iba-1和GFAP信号，AEP的敲除选择性地抑制了Iba-1和GFAP活性（图3 H-J），表明AEP在介导C/EBPβTg小鼠HFD触发的神经炎症中起关键作用。HFD处理的C/EBPβ Tg小鼠中，Aβ和Tau病理均达到峰值，海马和皮质中积累的蛋白质包涵体增高，Aβ4水平增高，均在C/EBPβ/AEP -/-小鼠中显著下降（图3K-M）。因此，HFD会在C/EBPβ Tg小鼠的大脑中引发胰岛素抵抗和AD病变，而AEP对于这种作用是必不可少的。
（图源：P Liu et al., Mol Psychiatry, 2022）
作者进一步检查了HFD对C/EBPβ Tg小鼠和C/EBPβ/AEP -/-小鼠的AD病理学的影响。HFD增强了C/EBPβTg小鼠的BACE1总水平，并且所有这些生化事件在C/EBPβ/AEP-/-小鼠中均显著减弱（图4 A,B）。在两种喂养条件下，AEP的敲除显著挽救了C/EBPβ/AEP -/-小鼠中树突分支和树突棘的减少（图4 C）。HFD治疗导致C/EBPβTg小鼠突触蛋白显著减少，C/EBPβTg小鼠中AEP的缺失恢复了突触蛋白（图4 D）。莫里斯水迷宫（MWM）测试表明，在两种喂养条件下，C/EBPβ Tg小鼠记忆力受损。此外HFD还大大减少了C/EBPβTg小鼠在平台象限中花费的时间。由于一些C/EBPβ/AEP-/-小鼠不能很好地游泳，因此无法在MWM测定中分析它们的认知功能（图4 E）。恐惧条件反射测试表明，在两种喂养条件下，C/EBPβTg小鼠与WT小鼠相比表现出明显的认知缺陷，HFD显著损害C/EBPβTg小鼠的认知功能。从C/EBPβ Tg小鼠中敲除AEP可恢复由HFD引发的认知缺陷（图4 F）。因此，HFD会引起Thy1-C/EBPβ Tg小鼠的认知功能障碍，而AEP是该作用所必需的。
（图源：P Liu et al., Mol Psychiatry, 2022）
HFD会导致糖尿病和AD病理并刺激C/EBPβ Tg小鼠的学习和记忆障碍，而C/EBPβ/AEP通路在这些事件中起着至关重要的作用。由于C/EBPβ 和炎症相互调节[15]，研究者想知道HFD引发的慢性炎症是否与这两种疾病相结合，并通过激活C/EBPβ/AEP信号传导来驱动发病机制。为了验证这个概念，作者用细菌分泌的一种内毒素LPS（脂多糖）长期治疗这些动物诱发炎症发现，除了介导报道的LGMN和IL-6基因外，C/EBPβ可能作APP、MAPT 和BACE1的转录因子，驱动这些关键基因在AD发病机制中的表达。LPS上调小鼠C/EBPβ并增加其下游靶标AEP、APP、Tau和BACE1的表达水平，且均在C/EBPβ Tg小鼠中高度增强，导致活性AEP和APP N585和Tau N368被活性AEP裂解、p-Tau AT8活性升高。这些事件C/EBPβ ±小鼠中明显减少（图5A）。与WT或C/EBPβ±小鼠相比，LPS在C/EBPβTg小鼠的大脑中大大增强了IL-1β、IL6和TNFα（图5C）。此外，当AEP耗尽时LPS刺激的C/EBPβ Tg小鼠的生化效应大大降低（图 5D）。LPS治疗显著增加了WT小鼠中的Iba-1和GFAP信号。这些效应在C/EBPβ Tg小鼠中得到进一步增强。相反，AEP的缺失大大降低了Iba-1阳性小胶质细胞活化和GFAP阳性星形胶质细胞增生（图5 E,F）。Nissl染色显示LPS刺激的C/EBPβ Tg小鼠海马体积减少并伴有脑萎缩，这种效应在C/EBP ±和C/EBPβ/AEP -/-小鼠中得到改善。与作者之前的观察结果一致，用LPS处理的C/EBPβ Tg小鼠的海马CA1和CA3区域的海马神经元明显减少。因此，慢性LPS在C/EBPβ Tg小鼠的大脑中引发C/EBPβ/AEP 信号激活、神经炎症以及APP和Tau片段化，与海马萎缩相关。
（图源：P Liu et al., Mol Psychiatry, 2022）
研究慢性LPS刺激是否会触发C/EBPβ Tg小鼠大脑中的AD病变？研究者发现LPS刺激了WT或C/EBPβ±小鼠中广泛的Aβ聚集体（图6 A,B），LPS未能刺激C/EBPβ/AEP -/-小鼠中的Aβ积累（图 6C）。LPS在C/EBPβ Tg小鼠中两个部分中的Aβ40和Aβ42水平显著增强，而在WT、C/EBPβ ±或C/EBPβ/AEP -/-小鼠中它们保持不变（图 6D）。C/EBPβ或AEP的敲除减轻了慢性LPS刺激引起的海马中Tau的过度磷酸化（图6E,F）。值得注意的是，共染色显示AT8阳性神经元也是hS阳性，表明NFT在C/EBPβ Tg小鼠海马中的这些神经元中积累，银染色进一步证实了这一点（图 6G）。LPS慢性治疗后C/EBPβ Tg小鼠的过程交叉和过程交叉显著减少。高尔基染色显示，与WT小鼠相比，C/EBPβTg小鼠的树突棘显著减少，而敲除C/EBPβ或AEP减轻了这些影响。IB分析表明在慢性LPS治疗后，C/EBPβTg小鼠的突触蛋白明显减少，这在C/EBPβ/AEP -/-小鼠中得到缓解。LPS强烈增加WT小鼠中的炎性细胞因子（IL-1β和IL-6），在C/EBPβ Tg小鼠中进一步增强，在C/EBPβ/AEP -/-小鼠中被消除。MWM测试支持慢性LPS刺激在C/EBPβTg小鼠中引发学习和记忆缺陷而不损害运动功能的观点。恐惧条件反射测试表明，LPS在C/EBPβ Tg小鼠中引发了显著的认知缺陷，但C/EBPβ/AEP -/-或 C/EBPβ ±小鼠对LPS刺激具有抗性。因此，这些结果支持 LPS 处理会刺激C/EBPβ Tg 小鼠的AD病理和认知功能障碍的观点，而AEP 是这种作用所必需的。
（图源：P Liu et al., Mol Psychiatry, 2022）
HFD或LPS诱导的慢性炎症触发神经元C/EBPβ/AEP信号激活，导致Thy1-C/EBPβTg小鼠的AD发病机制和认知缺陷。为了确定慢性炎症确实推动了这种效应，研究者用HFD预处理WT或C/EBPβ Tg小鼠2个月，然后用非甾体抗炎药（NSAID）阿司匹林和HFD联合处理1个月。发现与载体对照相比，阿司匹林大大减少了WT和C/EBPβ Tg小鼠这些组织中的炎症，并显著减弱小鼠中的AEP酶活性。与神经炎症减少一致，HFD触发的小胶质细胞活化和星形胶质细胞增生被阿司匹林显著抑制。阿司匹林还显著降低了HFD引发的C/EBPβ/AEP信号。因此，AEP剪切的APP N585和Tau N368片段化被强烈抑制，导致AT8活性降低。HFD引发的小鼠Aβ聚集体（4G8）和小鼠Tau过度磷酸化（AT8）被阿司匹林减弱。且阿司匹林抑制了HFD诱导的C/EBPβ/AEP信号激活和随后的活性AEP对APP N585和Tau N368的切割。因此，认知行为测试表明，阿司匹林治疗极大地挽救了C/EBPβTg小鼠中HFD引发的学习和记忆缺陷。总之，这些数据支持非甾体抗炎药阿司林在C/EBPβTg小鼠中阻断HFD诱导的神经炎症，并减轻胰岛素抵抗和AD病理，恢复认知功能。
总之，本文研究表明糖尿病相关的慢性炎症触发C/EBPβ/AEP信号的激活，导致Thy1-C/EBPβ转基因小鼠AD的发生，且抗炎药物阿司匹林在糖尿病的治疗作用之外还可能会改善AD的发病和进展。
通讯作者叶克强教授
（照片提供自：叶克强实验室）
参考文献（上下滑动阅读）
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本文完