PNAS︱王昌河课题组揭示神经突触胞吐-胞吞平衡新机制

撰文︱陈   洋，王昌河

责编︱王思珍

制版︱查佳雪

突触传递是神经元之间进行信息交流的基本方式，神经元的兴奋信息以不同的动作电位发放模式进行编码，动作电位到达突触前膜引起突触前膜去极化，Ca²⁺内流，进而触发囊泡融合（胞吐）与神经递质分泌[1]。胞吐之后，网格蛋白介导的胞吞（clathrin-mediated endocytosis, CME）、巨胞吞（bulk endocytosis）等多种胞吞模式协同作用与胞吐过程紧密偶联，以实现囊泡膜成分与膜蛋白的快速回收和再利用，这对维持细胞膜的动态平衡与神经递质的可持续分泌至关重要[2-4]。作为触发囊泡与质膜融合的信号分子，大量研究表明Ca²⁺还是触发和加速胞吞的关键分子，仍有许多研究表明Ca²⁺还可抑制胞吞但其机制不明，这使得Ca²⁺对胞吞的调控作用备受争议，成为本领域40年来的重要谜团[5-7]。

突触结合蛋白-1（synaptotagmin-1，Syt1）作为起始囊泡融合的Ca²⁺感受蛋白与分子开关，与complexin一起协同控制着SNARE（soluble N-ethyl-maleimide-sensitive fusion protein （NSF）attachment protein receptor）蛋白复合体的构象变化，进而起始囊泡与质膜的融合。除响应Ca²⁺直接触发囊泡分泌外，Syt1还参与了囊泡的锚定与激活过程，并可能通过与Stonin 2、AP-2等内吞蛋白的相互作用参与胞吞的调控过程[8-10]。然而，Syt1如何响应Ca²⁺参与胞吐-胞吞的偶联平衡调节，在不同神经兴奋模式下不同胞吞途径之间如何转换尚不清楚。

2022年05月11日，西安交通大学王昌河课题组在《美国科学院院报》（Proc Natl Acad Sci USA）上发表了题为“Synaptotagmin-1 is a bidirectional Ca²⁺ sensor for neuronal endocytosis”的研究论文，提出Syt1对不同胞吞类型的双向调控作用。陈洋、胡邵琴、吴轩昂和谢振丽为论文共同第一作者，王昌河教授为论文通讯作者。在此项研究中，作者发现，Syt1在胞吐-胞吞偶联过程中可促进速度较慢、形成小直径内吞囊泡的CME途径，而抑制速度较快、形成大直径内吞囊泡的巨胞吞过程，而Ca²⁺结合能力是Syt1响应不同神经兴奋水平精密调控不同胞吞模式的前提。体外脂质体实验中Ca²⁺相关的脂质体管状化的粗细程度提供了Syt1调节不同胞吞模式转换的分子机制。因此，Syt1是一个重要的对胞吞有着双向调控的Ca²⁺感受器，可通过调节膜的弯曲程度精确调控胞吞-胞吐之间的偶联平衡。

为系统研究Syt1对不同胞吞过程的调控作用，课题组首先采用了对pH敏感的绿色荧光蛋白pHluorin标记突触囊泡蛋白（synaptophysin-pHluorin, Syp-pH）对神经突触的胞吐-胞吞过程进行实时成像（图1 A, B），发现Syt1 敲低/敲除（KD/KO）的神经元在弱刺激条件下（45 mM K⁺）胞吞速度显著降低，而在强刺激条件下（70 mM K⁺或80Hz电刺激）整体的胞吞过程显著加速，且表现出更大比例的过度胞吞现象(图1 C-E)。对强刺激条件下 Syt1 KD/KO 神经元胞吞过程荧光值变化的动力学分析表明，KD/KO神经元存在两相胞吞过程，快速相胞吞（巨胞吞）被显著加速，而慢速相胞吞（CME）则速度变慢（图1 F-H），表明Syt1对胞吞过程具有双向调控作用，对快速相胞吞具有抑制作用，但对慢速相胞吞具有促进作用，以确保胞吐-胞吞过程的精密偶联与平衡。

图1 突触传递过程中Syt1对胞吞的双向调控作用

（图源：Yang Chen, et al., PNAS, 2022）

为进一步研究Syt1对不同胞吞模式的调控作用，研究人员在神经元中表达Syp-pH来标记突触囊泡（含分泌囊泡与内吞囊泡），通过dextran uptake标记内吞囊泡，采用超高分辨率（40 nm分辨率）STED成像观察内吞囊泡的大小和数量（图2 A, B），发现Syt1 KD/KO神经元中大直径内吞囊泡的数量和比例显著增加，而小直径内吞囊泡数量明显降低，表明Syt1可促进小直径内吞囊泡产生的慢速相胞吞过程（CME）而抑制大直径内吞囊泡产生的快速相胞吞（巨胞吞）过程（图2 C-F）。为更直观的验证Syt1对不同胞吞的调控作用，研究人员分别采用Transferrin uptake和40 kD Dextran uptake来检测CME和巨胞吞的胞吞速度，发现Syt1 KD/KO神经元中Transferrin uptake水平显著降低，而强刺激条件下40 kD Dextran的uptake水平则显著增强，表明Syt1的确可促进CME而抑制巨胞吞作用。同时，采用不同的Syt1突变体对KD神经元的挽救实验表明，Syt1 C2A和C2B 结构域均可以Ca²⁺依赖性地促进CME过程，但Syt1对巨胞吞的抑制作用严格依赖于C2B结构域与Ca²⁺的结合。

图图2 Syt1促进CME而抑制巨胞吞作用

（图源：Yang Chen, et al., PNAS, 2022）

最后，研究人员通过体外脂质体形变实验发现，Syt1可Ca²⁺依赖性地促进脂质体生成脂质小管，但存在粗、细两种不同的脂质体小管（图3），而在无Ca²⁺条件或去除C2B结合Ca²⁺能力的突变体则只能促进脂质体产生脂质粗管，而不能产生脂质细管，表明Syt1蛋白可介导脂质体发生两阶段的“弯曲形变”，而C2B结构域与Ca²⁺的结合是Sy1促进脂质粗管向脂质细管转变的关键所在，可能是促进巨胞吞模式向CME转变的分子基础。

 图3 Syt1介导脂质体的“两阶段”弯曲形变

（图源：Yang Chen, et al., PNAS, 2022）

 图4 Syt1调节不同胞吞模式的模式图

（图源：Yang Chen, et al., PNAS, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上，本研究证明突触结合蛋白-1（Syt1）可作为Ca²⁺感受器在神经突触中促进网格蛋白介导的胞吞（CME）以确保高效的膜回收，同时抑制巨胞吞以防止过度胞吞（图4），不仅发现Syt1对巨胞吞过程的抑制作用，还首次揭示了Ca²⁺对胞吞的抑制机制，终结了本领域长达40年之久的Ca²⁺对胞吐-胞吞偶联平衡双向调控的争议，并提出两阶段膜重塑模型，为不同胞吞模式之间的转换机制提供依据，并为其它膜融合与膜分裂事件的调控机制提供参考。

另外由于巨胞吞和超快速胞吞（ultrafast endocytosis）有很多相似之处（速度快，内吞直径大，均由网格蛋白介导胞吞内涵体上再生分泌囊泡）[11]，那么Syt1是否也会影响超快速胞吞还不清楚。此外考虑到Syt家族中不同Syt亚型之间的功能存在互补和代偿关系，不同Syt蛋白调控不同内吞途径中的结构基础和分子机制还需要更加全面和系统的研究。

原文链接：https://www.pnas.org/doi/10.1073/pnas.2111051119 

西安交通大学生命学院王昌河教授、北京大学柴祖映博士和黄荣博士为本文的共同通讯作者。博士生陈洋、胡绍琴、吴轩昂和谢振丽为本文的共同第一作者。西南医科大学康新江教授和徐华栋副教授等参与了该项研究，西安交通大学分析测试中心郝英工程师协助完成STED成像数据的采集，北京大学生命学院公共仪器平台胡迎春博士协助完成电镜数据的采集。该研究得到国家自然科学基金、陕西省科技创新团队项目、陕西省杰出青年基金、国家科技创新项目、四川省自然科学基金和中国博士后科学基金的资助。

陈洋（第二排左5），胡邵琴（第二排左2），谢振丽（第一排右1），王昌河（第一排右4）

（照片提供自：王昌河团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读）  

王昌河教授课题组主要研究方向包括：1）神经分泌与突触传递的调控机制，2）多巴胺系统相关神经疾病（帕金森病、精神分裂症、成瘾、痛）的病理机制。实验室拥有电生理（膜片钳记录、sniffer patch、UV-flash、钙成像）、电化学（微碳纤电极细胞/脑片/in vivo水平的实时记录、微透析-HPLC分析）、生物成像（confocal、TIRF、two photon、电镜等）、光遗传、行为学及分子生化等特色技术手段，在囊泡分泌与突触传递的分子机制和帕金森病等相关神经疾病的发病机理等方面取得一系列突破性研究进展。

王昌河教授课题组（http://gr.xjtu.edu.cn/web/changhewang）

王昌河教授（[e-mail]）团队常年招收教授、副教授、博士后、博士和硕士研究生。

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参考文献（上下滑动阅读）  

1.Haucke, V., E. Neher, and S.J. Sigrist, Protein scaffolds in the coupling of synaptic exocytosis and endocytosis. Nature Reviews. Neuroscience, 2011. 12(3): p. 127-138.

2.Cremona, O. and P. De Camilli, Synaptic vesicle endocytosis. Current Opinion In Neurobiology, 1997. 7(3): p. 323-330.

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5.Leitz, J. and E.T. Kavalali, Ca2+ Dependence of Synaptic Vesicle Endocytosis. The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry, 2016. 22(5): p. 464-476.

6.Südhof, T.C., Calcium control of neurotransmitter release. Cold Spring Harbor Perspectives In Biology, 2012. 4(1): p. a011353.

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8.Yao, J., et al., Uncoupling the roles of synaptotagmin I during endo- and exocytosis of synaptic vesicles. Nature Neuroscience, 2011. 15(2): p. 243-249.

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10.Wu, X., et al., Synaptotagmins: Beyond Presynaptic Neurotransmitter Release. The Neuroscientist : a Review Journal Bringing Neurobiology, Neurology and Psychiatry, 2020. 26(1).

11.Watanabe, S., et al., Clathrin regenerates synaptic vesicles from endosomes. Nature, 2014. 515(7526): p. 228-233.

本文完