Annu Rev Neurosci 综述丨操控不同神经细胞的腺病毒工具

来源︱AiBrain 

责编︱王思珍，方以一

编辑︱王思珍

腺相关病毒（AAVs）是神经科学研究的重要工具。对于神经科学的研究人员来说，需要根据试验对象和目的，选择合适的血清性和基因组元件AAV载体；而对临床工作者来说，面对现有的神经系统遗传疾病一筹莫展时，基于AAV的基因治疗可能会取得意外的惊喜。

腺相关病毒（AAVs）是神经科学研究和神经疾病基因治疗的主要基因递送载体。AAV能够转导分裂和非分裂细胞，非常适合于转基因递送。天然存在的血清型已被广泛用于神经科学研究，但它们效率和精确度有限。对AAV病毒衣壳和基因组的改造，可以作为特定细胞和组织类型的载体；通过特异性的基因调控元件控制转基因表达。

近期，美国加州理工学院Viviana Gradinaru教授（通讯作者）等人对AAV病毒的衣壳和基因组改造的理论基础和如何选择这些工程AAV工具操控不同物种的不同神经细胞，以及基于AAV的基因治疗在临床应用的前景和存在的相关问题进行了系统的介绍。文章以为“Adeno-Associated VirusToolkit to Target Diverse Brain Cells”题发表在了Annual Review of Neuroscience杂志上。

一、为大脑而设计的AAVs工具

许多天然的AAV血清型，因嗜性广泛而在脑实质内直接注射后广泛转导神经元和神经胶质细胞，而静脉内给药后虽能穿过血脑屏障(BBB)但效率低下。并且颅内注射具有侵入性，对大脑区域、细胞和回路覆盖不全。由于病毒颗粒从注射部位扩散，产生的转基因表达存在空间梯度。静脉注射需要较高的病毒剂量，有导致外周器官发生转导的可能，在高剂量下具有潜在毒性。脑脊液(CSF)内给药绕过了血脑屏障，但也具有侵入性且缺乏特异性。为了实现AAVs作为研究工具和人类基因疗法的使用，需要有效的、靶向的、非侵入性的载体。

为了增强和优化AAV的嗜性，对AAV衣壳的突突变体进行了广泛的研究。并且已经开发了血清型改组嵌合衣壳的构建方法，通过在细胞培养或体内的多轮选择，产生和筛选并建立了不同嗜性的衣壳突变体文库，为神经科学研究提供了庞大的工程化AAV衣壳阵列。

1.1 基于Cre重组酶的AAV改造方法将基因高效、无创和靶向地递送至小鼠大脑

基于Cre重组的AAV定向进化(CREATE)方法可用于筛选衣壳突变体文库，建立了能够转导表达Cre的转基因动物的特定细胞的衣壳突变体。鉴定出了具有增强嗜中枢神经系统的AAV9变异体(AAV-PHP.B)或周围神经系统(AAV-PHP.S)载体。AAV-PHP.B及其变异体AAV-PHP.eB通过修饰进一步增强了中枢神经系统转导。这些载体为实现对成年小鼠神经系统的非侵入性和特定基因操控提供了基础。

multiplexed-CREATE(M-CREATE)在细胞类型特异性和机械多样性两个方面进一步改进，这种方法鉴定出了嗜神经元特异性的AAV-PHP.N和嗜血管细胞的AAV-PHP.V1载体。还发现了全身注射后对中枢神经系统嗜性强的不同序列家族，包括几个称为AAV-PHP的序列家族；并且在不同的品系的小鼠中仍保持增强的CNS转导能力。

将AAV-PHP.B改造为更高效的AAV-PHP.eB和更具细胞特异性的AAV-PHP.N显示出了衣壳改造的优势。通过在AA588位置插入或引入新的位点，可以进行嗜性改良。在AAV-PHP.eB的AA452-458环中随机替换M-CREATE，发现AAV.CAP-B10载体在转导神经元的同时明显减少了对小鼠和绒猴星形胶质细胞、少突胶质细胞和周围器官的嗜性。

图1 AAV大脑靶向基因递送工具包。AAV (a)衣壳、(b)基因组和(c)递送方法决定细胞类型或区域特异性转基因表达。(a)现有的几种具有独特嗜性的工程化衣壳。(b)可以个体化定制遗传基因组以控制转基因表达。(c) 病毒递送方法包括聚焦超声、颅内、脑室内、肌注、鞘内和静脉给药。(d)工程化的全身性AAV靶向不同的脑细胞类型。（上）单次静脉注射AAV-PHP.eB后，广泛且有针对性的基因传递到大脑。核定位荧光报告基因分别使用hSyn1、GFAP或MBP启动子靶向神经元（绿色）、星形胶质细胞（蓝色）或少突胶质细胞（红色）。（底部、左侧和中间）细胞类型嗜性的AAV衣壳通过普遍存在的或细胞特异性的启动子执行独特的嗜性，显示了AAV-PHP.N（神经元）和AAV-PHP.V1（脑血管）。（右下）AAV-PHP.eB局限于星形胶质细胞的转基因表达。

（图源：Challis RC, et al., Annu Rev Neurosci, 2022）

1.2 AAV衣壳改造的其他方法

目前已经有很多新的靶向大脑的AAV衣壳。rAAV2-retro是在AAV2衣壳基因的AA587-588之间插入一个10聚体肽，能增强在神经元中逆向转运。SCH9载体可以增强室管膜下神经干细胞的嗜性。

iTransduce方法可以识别跨BBB的AAV，其中突变的AAV在细胞类型特异性启动子的控制下递送Cre，诱导转基因小鼠中荧光蛋白的表达。这允许通过细胞分选和鉴定AAV-F来恢复功能性衣壳，其增强的中枢神经系统转导在C57BL/6J和BALB/cJ小鼠中都得以保留。

BRAVE方法通过对突触具有亲和力蛋白质的改造形成了DNA衣壳插入库。BRAVE鉴定了多巴胺神经元中逆向转运增强的AAV2突变体MNM004。随着在野生型小鼠中示踪方法的AAV开发，为在非转基因物种的研究打开了大门。

图2 为大脑设计系统性AAVs的流程。用于发现具有独特嗜性AAV衣壳的简化流程包括以下步骤。1.构建AAV衣壳DNA文库。这是通过使用PCR使衣壳序列(彩虹)多样化来实现的。2. HEK293T细胞中构建多样化的AAV病毒文库。根据衣壳选择方法，在转基因或野生型动物中静脉注射AAV病毒文库。细胞类型特异性表达Cre的转基因小鼠用于CREATE方法，野生型小鼠用于TRACER方法。3. 2-3周后，收获感兴趣的组织并使用PCR扩增回收DNA(CREATE)或RNA(TRACER)。4. 通过深度测序分析回收的衣壳文库。5. 在体内筛选和验证衣壳突变体。(左)传统方法使用荧光报告基因表达。(中，右)病毒载体的高通量分析。

（图源：Challis RC, et al., Annu Rev Neurosci, 2022）

1.3 分子特征识别细胞特异的AAV嗜性研究

已经有几种具有中枢神经系统特异性嗜性的AAV，免疫组织化学已不足以分辨不同神经细胞类型之间AAV的嗜性。为了便于快速鉴定和详细表征已经设计的AAV的嗜性，并在分子水平识别细胞特异的AAV衣壳，需要高通量衣壳分析方法。

条形码载体基因组的测序方法提供了一个潜在的解决方案。将DNA和RNA条形码与下一代测序相结合，以监测先前在体内不同组织中发现的AAV突变体文库的性能，加速了发现嗜中枢神经系统的变异体。这种方法揭示了AAV-PHP.eB和AAV.CAP-B10载体转导的神经元细胞类型存在差异；这些转导特异性的差异，突出了寻找新的分子特征以表征细胞特异嗜性AAV的重要性。

空间基因组学方法为快速准确的AAV变异表征提供了另一种可能的解决方案。通过交换反应荧光原位杂交（SABER-FISH）的方法，将信号放大以允许原位检测AAV基因组，顺序荧光原位杂交(seqFISH+)实现了脑组织中的多重转录物检测和分子细胞分型。这种方法揭示了更精细的区域和细胞特异性嗜性，包括对神经元亚型或小胶质细胞的特异性。

二、适用于不同动物模型的AAVs

为了使基因传递工具更广泛地用于研究和最终的治疗用途，AAV衣壳和基因组必须在模型生物体内和遗传多样性背景下工作。年龄、性别、品系和物种，可以影响AAV在脑内的转导。

2.1 遗传因素影响AAV在小鼠脑内的转导吗？

实验室小鼠的遗传背景会影响大脑中的AAV转导特性。AAV-PHP.B和AAV-PHP.eB在特定的小鼠品系中失效，包括BALB/cJ小鼠。原因在于小鼠限制性蛋白Ly6a存在品系依赖性多态性，它是AAV-PHP.B和AAV-PHP.eB穿过BBB的受体。因此，这种品系适用于AAV-PHP.V1和AAV-PHP.N，它们是AAV-PHP.B序列家族的新成员。

然而，来自不同家族的AAV血清型在脑转导中没有表现出品系差异性。AAV-PHP.Cs和AAV-F在BALB/cJ小鼠中都有增强的转导能力。表明不同序列家族的衣壳突变体具有不同的BBB进入机制。在不同遗传背景的小鼠品系中测试AAV血清型，能够揭示跨过BBB差异的分子机制。

年龄和性别等生物学因素也会影响小鼠的AAV转导能力。与雄性小鼠相比，全身注射AAV9导致雌性小鼠的大脑转导率更高，而在肝脏内转导率更低。AAV的脑细胞类型偏好和穿过BBB的能力也可能取决于注射时的年龄。但需要做更多的工作来确定年龄、性别和其他因素对AAV血清型转导能力的影响，以及这些差异是否也存在于其他脊椎动物中。

2.2 在小鼠身上改造的AAV能用于非人灵长类动物吗？

这取决于载体和递送途径。AAV-PHP.B载体能在许多小鼠和大鼠品系中起作用，在非人灵长类动物静脉内递送后并不优于AAV9。这些结果与Ly6a在非人灵长类动物中不存在有关。

在猕猴中，AAV-PHP.B鞘内给药（绕过BBB）比静脉内给药能导致更多的CNS转导（AAV-PHP.eB在鞘内给药后优于AAV-PHP.B），但需要更多的研究来证明这些载体比AAV9更有优势。

尽管AAV-PHP.B载体静脉给药不会转导非人灵长类动物，但其他衣壳突变体在灵长类物种中表现出增强的嗜性。

AAV2-HBKO是一种改良的AAV2载体，具有增强的皮质和纹状体表达，在小鼠和猕猴颅内注射后表现为神经元嗜性转导。从AAV-PHP.eB改造而来的两种突变体（AAV.CAP-B10和AAV.CAP-B22）在狨猴中保留了增强的CNS转导和细胞类型特异性，比AAV9转导的神经元数量分别增加了四倍和两倍。

载体AAV.CAP-B10在狨猴中表现出较高的神经元嗜性和对肝脏的嗜性降低（静脉递送的AAV9主要转导猕猴中枢神经系统中的星形胶质细胞，而AAV9样载体AAVhu68在对非人灵长类动物进行高剂量全身给药后可引起肝损伤）。

AAV.MaCPNS1和AAV.MaCPNS2也是在小鼠中改造并应用于非人灵长类动物。rAAV2-retro（也在小鼠中鉴定）在猕猴大脑颅内注射后，显示出强大的逆行转导能力。这些研究表明，在筛选或验证非人灵长类动物中的新型AAV之前，可以使用啮齿类动物作为衣壳选择平台。

基于RNA的筛选，如TRACER（细胞类型特异性启动子驱动野生型小鼠衣壳突变体的表达）不需要转基因动物，可用于直接在非人灵长类动物中识别AAV衣壳。最近，非人灵长类动物中的多物种选择策略确定了AAV.CAP-Mac，这是一种工程化的系统性AAV突变体，在人类脑组织或区域特异性大脑类器官也是很有前途的应用系统。

图3 工程化AAVs在不同小鼠品系和非人灵长类动物中的使用。(a)来自不同序列家族的AAV突变体在C57BL/6J和BALB/cJ小鼠中显示出独特的转导特性。(b) AAV. CAP-B10在狨猴中枢神经系统转导仍然保留。(c) AAV在恒河猴大脑中的表达。(左)AAV.CAP-Mac静脉给药后优先转导幼猴脑中的神经元。(右)AAV.MaCPNS1和AAV.MaCPNS2在幼猴大脑中转导神经元和星形胶质细胞。图b和c中使用的启动子是普遍存在的CAG启动子。

（图源：Challis RC, et al., Annu Rev Neurosci, 2022）

三、为大脑特别改造的AAV基因组

细胞类型特异性也可以通过发现和改造基因调控元件来实现，这些元件通过启动子、增强子和microRNA(miRNA)靶位点赋予转基因特异性。

3.1 启动子和增强子

已经鉴定并验证了几种驱动转基因表达的脑细胞类型特异性启动子和增强子。这些元件大多数小于3kb（与AAV的有限遗传有效载荷兼容）并且可以与广泛嗜性的衣壳配对，将转录限制在特定的脑细胞和区域。

启动子可以驱动多种脑细胞类型（包括神经元、神经胶质细胞和血管细胞）。神经元类型特异性表达可以通过儿茶酚胺能细胞、5-羟色胺能细胞、小脑中的浦肯野细胞和表达小清蛋白的GABA能中间神经元以及其他亚型的启动子实现。在野生型小鼠中全身注射工程AAV载体后，已经验证了几种启动子的细胞类型特异性。

增强子（调节转录的短基因组区域）也可以驱动AAV载体的转基因表达。当与启动子结合时，增强子能够跨脊椎动物物种对大脑区域和细胞类型进行特异性标记。例如，mDlx增强子在斑胸草雀、啮齿动物、非人灵长类动物和人类细胞中局限表达于前脑GABA能中间神经元，并在使用AAV-PHP.eB静脉内递送给小鼠时保持区域和细胞特异性。

现代基因组方法（例如，开放染色质分析）已被用来寻找新的增强子并生成病毒工具。继续努力识别和验证增强子（尤其是在小鼠眼眶后注射后效率提高的元件）将极大地扩展AAV工具包。

启动子和增强子的强度和特异性取决于许多因素，包括载体剂量、动物模型、递送方法和衣壳。衣壳-启动子相互作用（其中AAV衣壳影响启动子驱动转基因表达的能力）已在大鼠和非人灵长类动物的中枢神经系统中得到报道。

一些广泛性启动子可以驱动AAV表达的能力强于细胞或组织特异性启动子。为了在大脑中实现强选择性表达，可以将广泛性启动子克隆到floxed转基因的上游，并将其递送至细胞类型特异性Cre或Flp重组酶表达小鼠。

或者，可以将表达外源重组酶或转录因子的增强子载体静脉内递送至转基因报告小鼠以进行强化标记能力。更强的启动子和/或多个增强子拷贝也可以强化AAV的转基因表达。

最后，转基因本身可以被设计来补偿低水平的表达。对报告物、传感器和效应器的继续改造也可以提高表达、灵敏度和靶向性。

3.2 miRNA的靶向位点提高特异性和安全性

细胞特异性也可以通过利用内源表达的miRNA来抑制非靶组织和细胞类型中的转基因表达来实现。miRNA是小的非编码RNA分子，通过结合3'非翻译区(UTR)中的互补靶序列来抑制mRNA表达。将miRNA目标位点克隆到AAV基因组的3'-UTR，可以减少非靶细胞中的转基因表达。当与强启动子结合时，可以在目标细胞中驱动高水平的转基因表达。例如，AAV-PHP.eB（一种广泛嗜性衣壳）可以通过将miRNA目标位点整合到其基因组中来向神经元或星形胶质细胞提供靶向转基因表达。

使用这样的方法想将表达限制在皮质的中间神经元，可以借助AAV9载体，在皮质内注射后抑制兴奋性细胞的表达。组织特异性miRNA位点可以包含在转基因盒中以减少外周器官的表达。miRNA去靶向策略还可以减少转基因相关的毒性和免疫反应。在非人灵长类动物的脑脊液内注射后，在背根神经节神经元中特异性表达的miRNAs消除了这些细胞中的转基因表达和毒性。肌肉内注射后，免疫细胞中表达的miRNAs抑制了特异性免疫反应，并允许用不同血清型的AAV对同一小鼠反复给药。

3.3 在时空上控制转基因的表达或功能

基因开关可以包含在AAV基因组中以调节体内表达水平。基于小RNA的开关（核糖开关）可以放置在转基因盒的3'-UTR中，以在反义寡核苷酸递送后开启表达。光或化学物质也可以用来诱导表达。Xon是一种药物诱导剪接开关，被开发用于控制基因表达水平。当整合到AAV-PHP.eB中时，Xon可以实现大脑靶向传递和基因编辑。如果在AAV递送后出现并发症，或者如果治疗只需要瞬时基因表达，则关闭开关将很有用。

时空控制可以通过光诱导重组酶或化学遗传学来实现。声学靶向化学遗传学将聚焦超声用于BBB打开和病毒载体递送与区域、细胞类型和时间特异性的化学遗传学相结合。表达控制系统的进一步优化可以允许对转基因（包括治疗基因）进行精确和有条件的调节，以提高AAV递送疗法在基础研究和转化研究中的安全性和有效性。

图4 空间、细胞类型和时间特异性的AAV基因组。(a，b)广泛嗜性衣壳可以通过将基因调控元件整合到AAV基因组中来递送靶基因表达。(a)已经发现了几种细胞亚型和大脑区域特异性增强子。这些元件可以用AAV-PHP.eB静脉内递送，以实现区域和细胞类型特异性。(b)在静脉内或颅内注射后，miRNA靶点可以分别限制不同细胞类型(例如神经元或星形胶质细胞)或亚型(例如皮质中间神经元)的表达。(c)转基因表达的时间控制可以通过药物诱导型剪接开关(Xon)来实现。(d)转基因表达的空间控制可以通过FUS-BBBO（聚焦超声血脑屏障开放）来实现。

（图源：Challis RC, et al., Annu Rev Neurosci, 2022）

四、基于AAV的治疗和基因组编辑

4.1 基因治疗

AAV作为遗传疾病的治疗性递送载体已经进行了几十年的研究。近年来，这种努力在治疗代谢、血液和神经肌肉疾病方面取得了明显的成功。美国食品和药物管理局批准Luxturna用于RPE65相关的视网膜营养不良；Zolgensma用于脊髓性肌萎缩症，这些表明基于AAV的疗法在中枢神经系统中是有效的。

随着对临床可用AAV工具包的进一步开发，与 AAV及其遗传物质相关的毒性值得关注。高剂量AAV基因治疗已报告了严重不良事件和死亡。

然而，临床前工作如果可以解决安全问题，将会增加治疗的潜力。在非人灵长类动物中，临床相关的AAV治疗（静脉内或鞘内递送至CNS）可导致背根神经节毒性，并且导致严重的共济失调。

在小鼠中，颅内注射AAV可以消融海马体中的神经祖细胞并破坏皮质中的树突复杂性和突触传递。了解毒性的潜在机制，以及它们如何在临床上表现出来，将为未来的治疗提供信息。

AAV诱导的毒性可在病毒给药后数天至数周发生，并在啮齿动物和非人灵长类动物注射后持续数月。因此，临床前实验需要延长时间点来预测和减轻患者的并发症。

最近在识别和表征新的AAV突变体和基因调控元件方面取得的进展，将促进基因疗法的临床开发。几项临床前研究证明了工程AAV载体治疗中枢神经系统疾病的能力。

将基因沉默的锌指蛋白转录因子通过AAV9局部输送到海马体，或通过AAV-PHP.B输送到全脑，可以抑制阿尔茨海默病小鼠模型中tau蛋白的表达。将miRNA调控元件设计到AAV的基因组中，包装治疗性转基因后，可以防止脑脊液内递送到Rett综合征小鼠模型后的过度表达。进一步开发和实施对转基因表达的时间、部位和数量施加控制的AAV元件将提高AAV基因疗法对不同病理学的安全性和有效性。

4.2 基因编辑

用于编辑和操纵基因组的工具为理解疾病中的基因功能和识别潜在治疗靶点提供了新的可能性。成簇规律间隔短回文重复序列(CRISPR)衍生工具能够操纵细胞的基因组、表观基因组和转录组。与高效和有针对性的载体递送相结合，CRISP工具有望改变临床前研究。

许多Cas蛋白的大尺寸限制了基于CRISPR的工具与AAV递送的整合。然而，较小的Cas蛋白已被表征，并且可以与向导RNA(gRNA)盒一起包装到单个AAV载体中。AAV介导的基于CRISPR的工具的递送也可以通过双载体系统实现：分别递送gRNA和Cas效应器，在AAV基因组中递送分裂的Cas蛋白以在转导后重组，或通过mRNA或蛋白质反式剪接。以最大限度地优化启动子、增强子和调节元件，将使基于CRISPR的工具广泛受益。

许多研究已经证明AAV传递的CRISPR工具在临床前研究中的前景。使用单个AAV传递Cas9和gRNA，无论是在脑实质内使用AAV9还是在全脑范围内使用AAV-PHP.eB，可以编辑家族性阿尔茨海默病小鼠模型中的致病突变。

利用分裂内含肽反式剪接，提供了胞嘧啶碱基编辑器(CBE)和腺嘌呤碱基编辑器，可以在多个目标组织中产生特定的单碱基对转换。使用AAV-PHP.eB的CBE系统在皮质和小脑中产生了强大的C·G-to-T·A，当用于纠正致病突变时，Niemann-Pick疾病小鼠模型的存活率增加。

基于CRISPR的工具也可用于在体内进行大型混合遗传筛选。脑实质内注射AAV9将gRNA文库传递到Cas9报告小鼠中，然后对基因组靶位点进行靶向捕获测序，可以确定胶质母细胞瘤的驱动基因。由于这些筛选的规模和实用性从根本上受到可检测细胞数量的限制，因此广泛转导大脑的AAV衣壳可能使基于CRISPR的工具进行更大规模的混合筛选成为可能。

图5 用于向大脑广泛和靶向递送基因的AAV载体。AAV衣壳的选择取决于许多因素，包括递送方法、靶细胞群和研究对象。AAV PHP.B和AAV-PHP.eB可以分别转导人源性脑器官和离体人新皮质。然而，仍有许多工作要做，以确定用于人类的系统性AAV。构成人类脑血管系统的细胞类型的发现和分子特征可以促进人类跨血脑屏障AAV的发展。

（图源：Challis RC, et al., Annu Rev Neurosci, 2022）

五、总结与展望

近年来，神经科学研究的AAV载体的发展取得了快速进展。

AAV衣壳和基因组的模块化，可以针对啮齿动物和非人灵长类动物的不同脑细胞类型。Addgene的质粒库（https://www.addgene.org）和AAV数据中心 (https://datahub.addgene.org/aav/)开放平台可以帮助研究人员查找和共享AAV数据，以加速生物医学研究。

通过扩展AAV工具包的可用性和实用性，研究人员可以使用工程AAV实现跨物种的微创、细胞类型特异性基因表达。

原文链接：https://doi.org/10.1146/annurev-neuro-111020-100834‍

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本文完