CMLS︱周志东团队揭秘酪氨酸羟化酶-多巴胺通路在帕金森病中的病理机制

来源︱“逻辑神经科学”姊妹号“岚翰生命科学”撰文︱周志东责编︱方以一，王思珍编辑︱王思珍

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一种发病率仅次于阿尔茨海默病（Alzheimer's Disease）的常见慢性神经退行性疾病[1]。PD影响运动神经系统，可导致运动障碍，包括震颤、动作迟缓、肢体僵硬和步态异常。患者也可能出现其他非运动性并发症，例如认知障碍，精神障碍，睡眠障碍以及疼痛和其他感觉障碍。PD主要影响中老年人，多在60岁以后发病，随着人口老龄化加速，该病的发病率迅速增长。我国大约有250-300万PD患者。目前已知进行性的中脑黑质多巴胺（dopamine，DA）能神经细胞死亡，相关脑区DA神经递质水平降低，是PD发病的病理基础。PD无法治愈，最终病人失去自理能力，多因并发症而死亡。因此，研究并揭示多巴胺能神经细胞死亡的分子病理生理机制对于PD的诊断和治疗具有重要的指导意义。

2022年11月22日，新加坡国立神经科学研究所临床科学家周志东博士研究团队在Cellular and Molecular Life Sciences上发表了题为“The role of tyrosine hydroxylase-dopamine pathway in Parkinson's disease pathogenesis”的研究。该研究采用多种疾病模型，揭示并论证了PD相关的基因突变影响酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase,TH)-DA通路，是导致DA神经细胞死亡的一个重要病理因素。对于深入认识PD的病理生理机制以及PD的治疗靶点提供了理论依据。

富亮氨酸重复激酶2（(Leucine Rich Repeat Kinase 2，LRRK2）基因突变可导致PD [2]。LRRK2蛋白激酶包含2527个氨基酸。和其他单基因突变所导致的遗传型PD相比，LRRK2突变最为常见。而且，致病型的LRRK2基因突变也可见于散发型PD患者中。在发病年龄、临床症状、疾病进展方面，LRRK2相关的PD和散发型PD很相似。目前LRRK2 蛋白激酶的自然底物尚未确认，LRRK2突变所引起的DA神经细胞退变的分子机制也不明了。

DA是大脑多巴胺能神经细胞合成的神经传导递质。人体合成DA以酪氨酸作为起始合成底物，而其中最关键的限速酶是TH。该酶的活性决定了DA神经细胞内DA的含量。DA本身没有毒性，但是，DA易被氧化，并产生毒性代谢物，包括氧自由基（reactive oxygen species，ROS）和多巴醌酮（dopaquinone，DAQ）等[3, 4]。研究发现一些PD基因突变和环境因素所导致的DA神经细胞死亡都与DA相关联[3, 5-8]。因此，作者推测DA以及TH-DA通路可能在LRRK2基因突变导致的DA神经细胞死亡过程中发挥作用。

为了证明这一推测，作者检测了野生型、G2019S致病突变型以及激酶失活突变型全长LRRK2基因或LRRK2基因片段稳定转染的人类DA能SH-SY5Y神经细胞系和瞬时转染的大鼠DA能PC12细胞系中DA和TH的水平。结果发现，过度表达野生型和G2109S突变型LRRK2均可提高 TH和DA水平，而表达激酶失活型LRRK2则导致TH和DA水平下降。表达G2019S突变型LRRK2可导致DA细胞脆弱易死亡。而甲基酪氨酸（α-methyl-tyrosine，AMT），一种特异性的TH酶抑制剂，可逆转突变型LRRK2导致的多种异常变化。这些结果显示突变LRRK2所导致TH-DA通路异常并与DA神经细胞死亡有关联的体外证据。

图1 LRRK2对果蝇大脑DA神经细胞TH-DA通路的影响

（图源：ZD Zhou, et al., Cell Mol life Sci, 2022)

在转基因果蝇模型中，作者发现在果蝇头部DA神经细胞内表达人类G2019S突变型LRRK2可导致果蝇出现PD样症状，并伴有DA神经细胞的丧失。用高压液相色谱监测果蝇头部DA含量，发现在表达人类野生型和突变型LRRK2果蝇的头部，特别是表达突变型LRRK2果蝇的头部，DA含量先出现明显的增高，然后随时间推移迅速下降，并在40到60天左右低于正常水平。用RNA干扰（RNAi)抑制内源性果蝇LRRK2基因表达则可降低果蝇头部DA和TH水平（图1）。作者也发现，表达人类突变型LRRK2可导致果蝇头部不溶解ROS和DAQ修饰蛋白的沉积。而在食物中加入低剂量AMT，持续喂食果蝇后，突变LRRK2所导致的果蝇PD样症状、DA神经细胞丢失、异常DA水平以及不溶解修饰蛋白的沉积都可得到纠正或者缓解（图2）。以上结果显示突变LRRK2干扰TH-DA通路并导致果蝇DA神经细胞死亡的体内证据。

图2 AMT可对抗LRRK2对果蝇大脑DA神经细胞TH-DA通路的影响

（图源：ZD Zhou, et al., Cell Mol life Sci, 2022)

在转基因小鼠模型中，转基因表达G2019S突变LRRK2可导致早期（3个月以前）小鼠中脑中TH表达水平升高，而随着时间推移TH水平又逐渐下降（图3）。到20个月时，LRRK2突变转基因小鼠中脑中的TH蛋白水平已经明显低于正常小鼠（图3）。同时，小鼠脑中DA水平也有类似的变化趋势。在另一种致病性R1441G突变LRRK2转基因小鼠脑中，突变LRRK2也引起了类似的DA和TH水平变化（图3）。而且，G2019S突变LRRK2转基因小鼠中脑里也出现了DAQ修饰蛋白随着时间而累积的情况，提示突变LRRK2引起小鼠脑中DA生成过多并导致DA代谢产物毒性（图3）。这些结果进一步验证了突变LRRK2对TH-DA通路的干扰和对小鼠DA神经细胞的影响。

图3 突变LRRK2对转基因小鼠脑中TH-DA通路的影响

（图源：ZD Zhou, et al., Cell Mol life Sci, 2022)

作者进一步采用PD患者细胞诱导形成的干细胞而分化产生的人类DA神经细胞和迷你中脑组织模型。作者发现G2019S突变LRRK2增加人类DA神经细胞和迷你中脑组织中的TH和DA水平（图4）。作者也发现，随着时间的推移，带有G2019S突变LRRK2的人类迷你中脑组织中TH水平不断下降。到第127天时，TH蛋白几乎消失不见（图4）。免疫组织化学显示突变LRRK2激活了人类迷你中脑组织中导致细胞死亡的caspase3（图4）。以上结果显示了在干细胞演化的人类DA细胞和中脑模拟组织中突变LRRK干扰了TH-DA通路，并导致DA神经细胞死亡。

图4 突变LRRK2对PD患者细胞衍化生成的DA神经细胞和迷你中脑模型中TH-DA通路的影响，并导致DA神经细胞死亡

（图源：ZD Zhou, et al., Cell Mol life Sci, 2022)

过去的研究报道了与PD相关的PTEN 诱导的蛋白激酶1（PTEN induced Kinase 1，PINK1）基因可以调节TH-DA通路，野生型PINK1抑制，而致病性PINK1突变增高TH和DA水平[8]。作者推测LRRK2和PINK1可能在TH-DA通路上有交集。结果发现表达野生型人类PINK1基因可降低果蝇DA神经细胞TH和DA水平。而表达G309D致病性PINK1突变则早期增高TH和DA水平，晚期却降低果蝇脑中DA水平。这和突变LRRK2所导致的变化非常相似。而表达野生型PINK1可缓解突变LRRK2所导致的果蝇TH-DA通路异常和PD样症状。而表达G309D突变型PINK11却不行。这些结果印证了LRRK2和PINK1基因在TH-DA通路上有交集，且作用相反。

在人HAP1细胞内敲除LRRK2基因，可增加PINK1蛋白水平，而表达突变LRRK2则降低PINK1蛋白水平。类似情况也发生于果蝇模型中。在稳定转染的人SH-SY5Y细胞、转基因小鼠脑中、PD患者细胞演化而形成的人类DA神经细胞和迷你中脑组织中，突变LRRK2均可降低PINK1蛋白水平。LRRK2并不影响PINK1基因的转录水平。而蛋白质体抑制剂MG132则可纠正LRRK2导致的PINK1蛋白水平降低。以上结果提示突变LRRK2可促进蛋白质体降解PINK1蛋白。

另一方面，在人HAP1细胞中敲除PINK1则会增加LRRK2蛋白水平。在稳定转染的人SH-SY5Y细胞中，表达野生型PINK1可降低LRRK2蛋白水平，而表达致病性的A339T、E231G PINK1则可增加LRRK2蛋白水平。类似情况也发生于转基因果蝇模型中。PINK1也不会影响LRRK2基因的转录水平。同样，野生型PINK1导致的LRRK2蛋白水平降低也可被MG132纠正。以上结果显示PINK1可促进蛋白质体降解LRRK2蛋白，并可被PINK1突变影响。

图5 工作总结图：LRRK2-PINK1蛋白激酶分子对调控TH-DA通路并影响DA神经细胞活度

（图源：ZD Zhou, et al., Cell Mol life Sci, 2022)

文章结论与讨论，启发与展望

本研究使用了不同层次的疾病模型，论证了LRRK2对TH-DA通路的影响以及与DA神经细胞死亡的关系。研究证据显示LRRK2和PINK1形成了一个激酶蛋白分子对（图5）。在DA神经细胞内，它们通过互相抑制对方的蛋白水平，调节 TH表达，从而调控DA神经细胞内的DA水平，并最终影响DA神经细胞的活度。在生理情况下，LRRK2-PINK1形成平衡，DA细胞可维持适量的TH和DA水平以及正常的DA神经细胞功能。当LRRK2突变时，LRRK2的激酶活性增强，促进TH表达，同时，突变的LRRK2可促进PINK1蛋白降解，抑制PINK1的功能，引起LRRK2-PINK1失衡，结果DA细胞生成过多的TH和DA，导致DA代谢产物毒性，影响DA神经细胞的活度。当PINK1基因突变时，PINK1激酶活性降低，PINK1促进LRRK2降解和抑制TH表达的作用被削弱，这也导致LRRK2-PINK1失衡，最终也影响DA神经细胞活度。因此，调节LRRK2-PINK1激酶分子对平衡的疗法可能具有保护DA神经细胞的作用。本研究使用低剂量的AMT，一种TH酶抑制剂，可对抗LRRK2毒性，保护果蝇DA神经细胞。过去的研究显示AMT可以对抗多种PD基因突变导致的DA神经细胞死亡[3, 7, 8]。AMT是一种口服的TH抑制剂，可治疗嗜铬细胞瘤导致的高血压、肌张力障碍、自主运动障碍和亨廷顿病[9-11]。患者对AMT耐受良好，长期（3年）用药没有明显副作[10]。因此，长期低剂量AMT用药可能是一种保护DA神经细胞，缓解PD进展的疗法，需进一步探索。总之，本研究对于PD的病理机制提出了新的观点，为PD的预防和治疗提供了新的通路靶点和研究基础，意义重大！

原文链接：https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC9678997/

周志东

（照片提供自：周志东课题组）

第一及通讯作者简介（上下滑动阅读） 

周志东，1996年毕业于南通医学院医学系，2003年毕业于中国科学院上海分院，获博士学位。2003-2008年在新加坡国立大学生物医学系从事博士后研究。2009年加入新加坡国立神经科学研究所帕金森病研究组。2012年起任转化医学治疗实验室临床科学家。长期以来从事帕金森等神经退行性疾病的转化医学研究，特别是寻找、验证具有临床应用前景的生物标记物、分子治疗靶点以及临床新药的筛选等研究。以第一／通讯 (含共同) 的身份发表50篇SCI论文，包括Nature Review Neurology, Jama Neurol, Mol Neurodegenration, Movement Disorders, Human Mol Genetics, Science Signaling等国际权威杂志。曾获得新加坡国家医学研究理事会转化医学研究奖（Transition Award, National Medical Research Council,Singapore), 美国-新加坡人类长寿催化研究奖（Human Longevity Catalysis Award, NAM,USA-NMRC,Singapore), 杜克-国立大学许氏基金桥梁经费研究奖（Khoo Bridge funding Award, Duke-NUS Medical School, Singapore)等多个奖项。

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本文完