Nature | TEDDY项目中早期儿童的肠道微生态的时序发展

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文章速递

本文收集了来自德国、瑞典、芬兰和美国三个地区（科罗拉多、乔治亚和华盛顿）的 903 名儿童的 3-46 月的粪便样本，最终测序得了 12,005 份 16S 测序数据和 10,867 份宏基因组数据。通过分析肠道微生物的组成和功能，可将中早期（46月之前）婴儿肠道微生态的发展分为三个阶段：发展阶段（developmental phase，3-14月）、过渡阶段（transitional phase，15-30月）、稳定阶段（stable phase，31-46月）。同时，发现母乳喂养是影响中早期婴儿肠道微生态结构最重要的因素，母乳喂养使肠道中双歧杆菌（Bifidobacterium）丰度较高，停止母乳喂养将会加速肠道微生态的成熟。

除此之外，婴儿的分娩方式与发展阶段的肠道微生态显著相关，顺产使肠道中拟杆菌（Bacteroides）丰度较高，而拟杆菌与肠道微生态的多样性和肠道的成熟相关。其他的环境因素，例如地理位置、家庭情况（是否有同住兄弟姐妹、是否饲养有毛宠物）也与中早期婴儿的肠道微生态有显著的关联。

关键字: temporal development, gut microbiome in early childhood

Title: Temporal development of the gut microbiome in early childhood from the TEDDY study

DOI: 10.1038/s41586-018-0617-x

Journal: Nature [IF 40.137]

First Authors: Christopher J. Stewart

Correspondence: Christopher J. Stewart, Joseph F. Petrosino

Affiliation: Alkek Center for Metagenomics and Microbiome Research, Department of Molecular Virology and Microbiology, Baylor College of Medicine, Houston, TX, USA.

Published: 2018-10-24

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研究背景

 

之前的文献已经报道了22种与婴幼儿肠道微生态相关的协变量（见表1），本文详细探究了这22中协变量与婴幼儿中早期肠道微生态的关系。

表1 22种与婴幼儿肠道微生态相关的协变量

与母亲相关的	与婴儿相关的	补充剂	环境	疾病
BMI	性别	益生菌	地理位置	抗生素使用
妊娠期体重增加 （过量或非过量）	顺产 剖腹产	维生素D	家庭兄弟姐妹	是否乳糜泻
糖尿病 （妊娠期，T1D，T2D或无）	是否早产		家庭是否有毛宠物	任意慢性疾病
糖尿病药物 （胰岛素，二甲双胍， 格列本脲，抗高血压药）	母乳 和/或 配方奶粉		与动物一起生活的农场	任意急性疾病
先兆子痫	固体食物		日照
母体益生菌消耗

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研究结果

2.1 儿童中早期肠道微生物的发展可分为三个阶段

对 3-46 月全部样本的 16s 数据，利用 Dirichlet multinomial mixtures （DMM） 聚类方法进行聚类，并根据 lowest Laplace approximation 的方法确定最适合的类数，最终将样本聚类成 10 类。 

利用 linear mixed-effects modelling 对含量最高的5个门（放线菌门、厚壁菌门、变形菌门、拟杆菌门、疣微菌门）和 Shannon 多样性指数进行分析，确定了 46 月之前婴儿肠道微生物发展过程的 3 个阶段。

在发展阶段，五个门和多样性指数都显著的变化；

在过渡阶段，只有变形菌门和拟杆菌门以及多样性指数显著变化；

在稳定阶段，没有显著变化。

多样性在 10 类中逐渐上升，类1 - 类3，部分类4 - 类5 为发展期，主导菌群为双歧杆菌；类4 - 类8 为过渡期；类8 - 类10 为稳定期，具有很高的多样性以及厚壁菌门成为了主导菌群。将同样的方法应用于 metagenomics 数据，可将样本聚成 18 类，同时可能得到一致的 3 种阶段。

图1. a）DMM聚类的10类结果；b) 多样性在10类中持续上升；c）不同类在不同阶段的样本情况，每个节点大小代表其中样本的数量；由于每个婴儿在不同时间段取样，节点之间的连线的颜色，代表样本的过渡（transition），即从一个时间点变化到下一个时间点，原来属于连线前节点类的样本，过渡到连线后节点类的比例 。

2.2 母乳喂养是导致中早期婴幼儿肠道微生态差异的主要因素

文章中对三种不同水平的数据结果（16s 数据的属水平结果、metagenomics 的种水平的结果、KEGG 的模（modules）水平结果）进行了协变量关联分析，并以 3 个月为间隔，将 3-40 月分为 8 个时间段。结果显示，即使只有 10 % 的样本是母乳喂养，母乳喂养依然是与 3-14 月婴幼儿肠道微生态最相关的协变量（图2）。

图2. a）16s 的属水平结果； b）metagenomics 的种水平的结果； c）代谢水平（KEGG 的 modules 水平结果） *为显著相关。

无论是否是单一饮食 / 与固体食物配合，母乳喂养对肠道微生态都有很显著的影响；在属水平，与母乳喂养最相关的是双歧杆菌属，在种水平，有 121 种相关的菌种，其中高表达的包括三种双歧杆菌（B. bifidum, B. breve, B. dentium），一种乳酸菌和一种葡萄球菌；低表达的包括大肠杆菌等。之前的文献报道，双歧杆菌和乳酸菌可以在乳晕皮肤上定植，因此这些物种可以直接转移给婴幼儿。

长双歧杆菌（B. longum）虽然并没有与母乳喂养显著相关，但在 3-40 月，对与比其他双歧杆菌一直保持很高的丰度。（图3b）与《 TEDDY研究中早发1型糖尿病的肠道微生物组 》的结果显示，大部分长双歧杆菌都含有人乳寡糖（HMO）基因簇，在断奶之后，大部分长双歧杆菌都失去了这些基因。这可能反映了长双歧杆菌的两个亚型可以利用哺乳动物寡糖和植物寡糖的能力。在断奶之后，能将 HMO 转变为粘蛋白降解的双歧双歧杆菌（B. bifidum）依然存在。

该文同时发现高表达的三种双歧杆菌组成了 metagenomics 数据 DMM 聚类结果类1 - 类3，且在糖利用上具有显著差异。上述结果表明，不同的营养物质会促进不同的双歧杆菌定植。

2.3 终止母乳会促进肠道微生态的成熟

文章中利用微生物年龄（microbiota age）和MAZ值（microbiota-by-age Z-scores）两个指标来评估微生态的成熟情况。

在早期，母乳喂养的婴幼儿肠道微生态由于双歧杆菌主导，导致多样性较低，但随着年龄增长，母乳在饮食中比例下降，多样性会增加到与从未母乳喂养的婴幼儿相似，并随着年龄增长继续上升并高于从未母乳喂养的婴幼儿（图3 d）。在断奶之后，110种（89种属于厚壁菌门）细菌丰度显著上升。之前文章报道母乳喂养会抑制厚壁菌门定植。结合上述两点，终止母乳才是促进肠道微生态成熟的关键，而非饮食中引入固体食物。

母乳喂养是唯一与代谢能力（KEGG的模水平结果）相关的协变量（图2 c）。3-14 月所有样本的显著差异的 modules 聚类结果表明样本按照是否母乳喂养进行聚类（图3 e）。

通过回溯比对到 KEGG modules 的 reads 比对到的基因组，可分析 modules 来源于哪些物种。计算每个物种中显著与母乳喂养相关的 modules 的个数。对于母乳喂养的婴儿，在 6 个月之前，B. breve包含最多的显著相关 modules，6 个月之后被 B.bifidum 替代。在非母乳喂养的婴儿中，在 3-14 月，大肠杆菌为包含最多显著相关的 modules 的物种（图3 f）。这提供了新的证据证明肠道微生物在终止母乳后在物种和功能上快速成熟。

图3. a）3-6/7-10/11-14月三个时间段中，不同母乳喂养模式样本的MDS分析； b）0-40月，不同母乳喂养模式的婴儿占总数的变化情况（上图），不同双歧杆菌含量随时间的变化（下图）； c）不同母乳喂养模式的婴儿的多样性随时间的变化； d）不同母乳喂养模式的婴儿的microbiota age和MAZ随时间的变化； e）三个时间段中，母乳喂养、非母乳喂养的样本的KEGG modules聚类结果； f）在三个时间段里，包含最多显著相关modules的菌在母乳喂养（红色）非母乳喂养（黑色）的婴儿中不同

2.4 16s的结果也显示T1D婴幼儿在早期与健康婴幼儿之间差异较小 

TEDDY队列研究的另一篇关于早发1型糖尿病的肠道微生物组的研究成果表明了metagenomics数据结果显示与T1D相关的微生物信号较弱 ，本文分析16s的结果亦没有得到强烈的信号结果。

2.5 其他与中早期婴幼儿肠道微生物相关的协变量

出生模式在第一年里与肠道微生态显著相关，顺产样本包含高丰度的拟杆菌（Bacteroidetes）（图4）。不同的母乳喂养模式以及地区因素导致了微生物分层（图5）。家庭中有同住兄弟姐妹、饲养有毛宠物会加速早期肠道微生态成熟（图6）。

图4. 剖腹产（红色）顺产（蓝色）婴儿中拟杆菌丰度随时间的变化

图5.  不同地区婴儿中不同拟杆菌的丰度随时间的变化

图6. 三种环境因素（地区、家中是否有兄弟姐妹、家中是否饲养有毛宠物）对婴儿肠道微生物多样性、microbiota age、MAZ 的时间发展上的影响

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讨论与总结

 

本文的结论与之前在西方人群中的报道一致，但如果要将该T1D样本的结果推广到其他样本仍然需要谨慎。

本文提出了婴儿早期微生态发育假设，但确定改变早期微生态的机制和随后对于免疫发育和功能的影响依然十分重要。

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M 菌说

本文完整地描述了婴幼儿中早期（3-46月）肠道微生态的发育过程。其中涉及到最重要的分析方法：

1）DMM聚类与linear mixed-effects modelling：分类与将时间分为3个阶段

2）Microbiota age：随机选择150个婴儿（最后收样婴儿年龄大于37月，顺产，母乳喂养，收集每个志愿者的粪便样本数不少于10），使用随机森林的方法建立了模型，用于判定样本的微生态年龄。

参考文献

Stewart C J, Ajami N J, O’Brien J L, et al. Temporal development of the gut microbiome in early childhood from the TEDDY study[J]. Nature, 2018, 562(7728): 583.

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