2 个大队列，多维数据，再论肠道与心血管疾病

荷兰格罗宁根大学傅静远团队最近在《Circulation Research》发表一项肠道微生物、血浆代谢组和免疫组多组学的大队列人群横断面研究，系统揭示了评估微生物组与血浆代谢组，心脏代谢表型和 CVD 风险之间的功能联系，并在有充分证据的队列中确定饮食 - 微生物 - 代谢 - 免疫相互作用。

有趣的是，这项研究中设计 2 个队列，一个是平均 BMI 为 25 的基于人群的 Lifelines-DEEP（LLD） 队列（n = 978），另一个则是平均 BMI 为 31 的肥胖队列（300-OB）（n = 297）。但为什么要设计这样的 2 个队列，且看下文。

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文献速递

本研究设计 2 个大队列（LLD 队列和300-0B 队列），从血浆代谢物、肠道微生物、饮食、细胞炎症因子、粪便 SCFAs 多维度探究饮食、微生物、代谢、免疫与 CVD 风险。

作者先后比较了 2 个队列微生物对血浆代谢物变异解释度的差异，在校正年龄，性别和 BMI 之后，肠道微生物组可分别解释基于人群和肥胖群体的血浆代谢物变异的高达 11.1％ 和 16.4％ 。

在 300-OB 队列中，血浆中的脂蛋白亚类 VLDL、IDL 和 LDL 等脂质组分与肥胖特异性微生物关联，特别是细菌 L-蛋氨酸生物合成和 Ruminococcus 物种分别与动脉粥样硬化和肝脏脂肪含量相关。

在 LLD 队列中，研究还找到了 48 个 pathway 与 CVD 的代谢风险评分（MRS）相关，并且这些关联大部分独立与饮食和炎症。

此外，数据还显示与 CVD 风险相关的有可能是血浆的 SCFAs 而不是粪便中的 SCFAs 水平。

Keywords: Gut microbiome, metagenomics, metabolomics, atherosclerosis, cardiovascular disease risk factors, liver fat, metabolism, inflammation, population studies 

Title: Gut Microbial Associations to Plasma Metabolites Linked to Cardiovascular Phenotypes and Risk: A Cross-Sectional Study 

DOI: 10.1161/CIRCRESAHA.118.314642 

Journal:  Circulation Research  [IF 15.211] 

First Authors: Alexander Kurilshikov,Inge CL van den Munckhof 

Correspondence: Jingyuan Fu 

Affiliation: Genetics, University Medical Center Groningen 

Published: 2019-4-11

研究背景

虽然已有研究报道了 CVD 肠道微生物的研究，但是 CVD 中肠道微生物功能和饮食 - 微生物 - 代谢 - 免疫相互作用的研究知之甚少，因此需要多组学，基于系统生物学的方法去探究 CVD 中饮食 - 微生物 - 代谢 - 免疫相互作用。

队列设计：

LifeLines-DEEP队列（LLD）：本研究中 LLD 队列是荷兰 LifeLines 队列中的子队列，剔除了 57 名服用抗生素或降脂药物和 11 名非禁食受试者的参与者，剩下的 978 名受试者（411 名男性和 567 名女性）的粪便宏基因组、血清代谢组和详细的饮食、12 种炎症标志物和 5 种粪便的短链脂肪酸（SCFAs）用于分析。

300 肥胖队列 (300-OB) : 纳入了体重指数（BMI）> 27 kg / m2，年龄在 55 至 80 岁之间的受试者，进行了详细的心脏代谢表型分析，包括评估颈动脉斑块和测量皮下和内脏脂肪组织和肝脏脂肪含量。队列纳入要求比较严格，排除各种手术史、用药史和近期心脏事件。

图 1.  研究队列设计

研究思路

文章进行 4 个方面的研究分析：

① 宏基因组与代谢组的关联分析：比较了 LLD 和 300-OB 2 个队列在 188 个物种和 562 个微生物代谢通路关联分析差异；

② 300-OB 队列中代谢组相关微生物特征与心脏临床表型的关联；

③ LLD 队列中，微生物代谢通路与 CVD 代谢风险评分（MRS，metabolic risk score）的关联；

④ MRS 与饮食因素，炎性细胞因子和 SCFAs 的整合分析。

图 2.  研究队列设计

研究结果

1健康和肥胖个体中血浆代谢组与肠道微生物组的关联

本研究来自荷兰两个独立队列，LLD 和 300-OB（队列建立见研究背景）。两个队列基本特征如下表。

经过质控和估计 ~2.2％ 缺失值后，确定了 188 个微生物物种、562 个细菌代谢途径和 231 个代谢性状进行后续的关联分析。

在校正年龄，性别和 BMI 后，代谢物分别与物种和代谢途径在两个队列的关联情况如下：

随后作者将所有鉴定的微生物通路和物种作为预测因子，通过 R 包 'glmnet' 的 LASSO 模型估算微生物因子解释的血浆代谢变化的比例。

其中，300-OB 关联数较少，可能原因是受到样品数的影响，但结果显示 LLD 中鉴定的微生物因子通常对 300-OB 的代谢变异具有较低的预测值（图3），进一步比较了两个队列的排前发关联强度和方向，即便 300-OB 样品数少，但是存在一些 LLD 没有相关关联，特别是脂蛋白亚类，同时，有些关联在两个队列相关方向是相反的。这些表明基于人群和肥胖群体之间的微生物关联存在一些强有力的差异。

图 3.  肠道微生物组解释的血浆代谢物变化

2300-OB 队列中代谢组相关微生物特征与心脏临床表型的关联

为了探索与血浆代谢物相关的微生物因子是否与心血管疾病临床表现相关，作者重点关注在在 2 个队列中相关系数排前的物种和 pathway，并计算它们与 26 个心脏临床表型的相关性。

结果显示，在 300-OB 队列中，校正年龄，性别和 BMI 后，确定 2 个微生物因子和表现相关（图4）。

• 高丰度的细菌L-甲硫氨酸生物合成与斑块存在和最大狭窄程度显著相关；

• 瘤胃球菌 sp_5_1_39BFAA 与肝脏脂肪含量（Liver-fat）呈正相关。

虽然已有文献报道肠道微生物组衍生的 TMAO 可以增加心血管疾病的风险。但作者观察到本研究中，TMAO 的血浆水平与内脏脂肪呈正相关，但与动脉粥样硬化表型和肝脂肪不相关，也与代谢物相关物种和细菌通路不相关。

图 4. 300-OB 队列中肠道微生物通路和物种与临床结果的关联

3LLD 队列中，微生物代谢通路与 CVD 代谢风险评分（MRS）的关联

MRS（metabolic risk score）：为了评估人群队列中 CVD 病情发展的个体代谢风险，作者使用 33 个确定与未来 CVD 事件相关但又不和已知风险因素（年龄，性别，BMI 和吸烟状况）相关的代谢物 biomarkers 基于加权风险模型（图5）构建个体的 CVD 代谢风险评分（MRS）。

where Mi is the scaled level of the i-th metabolic marker in serum, not adjusted for phenotypes, and bi is a hazard ratio for the corresponding effect of each metabolic marker on the CVD risk as reported by Würtz et al [2].

在 LLD 队列中，校正年龄、性别和 BMI 后，发现了 48 个微生物 pathway 与 MRS 关联（图5）。

• GDP-甘露糖生物合成（PWY-7323）与 CVD MRS 负相关；

• 大量相关 pathway 涉及氨基酸（AA）代谢，包括谷氨酸家族 AAs（L-脯氨酸，L-精氨酸，L-组氨酸，L-组氨酸），支链 AAs（L-缬氨酸）的代谢。疏水性 AAs（L-苏氨酸），芳香族 AAs（L-苯丙氨酸和L-酪氨酸）和含硫 AAs（L-甲硫氨酸）。大多数氨基酸 pathway 与较低的 MRS 评分相关，除了L-甲硫氨酸和L-苏氨酸检测到正相关；

• 其他相关通路主要涉及发酵、碳水化合物和糖衍生物代谢等。

作者还鉴定了与 MRS 关联的 pathway 的驱动物种（drive species）。

结果表明，顶级分类群对 MRS 相关的微生物 pathway 贡献差异很大，相关系数介于 0.26 到 0.89 之间，平均值为 0.60。这表明一些 pathway 是由一种占主导地位的微生物驱动，而其他 pathway 可能由许多不同的微生物驱动。例如：

Bacteroidetes 门中的 Bacteroidia 科、Bacteroidaceae 属和 Rikenellaceae 属是 31 个 MRS 相关 pathway 中 17 种的主要驱动物种，尤其是 GDP-甘露糖生物合成和谷氨酸家族AA（r> 0.8）。相比之下，Ruminococcus 属和 Actinobacteria 门是 L-蛋氨酸代谢中的主要驱动物种，但贡献度较弱。

图 5. 48 个微生物通路与 CVD MRS、粪便 SCFAs、细胞因子和饮食因素的关联

4MRS 与饮食因素，炎性细胞因子和 SCFAs 的整合分析

• MRS 与炎症关联

作者还深入探讨了宿主-微生物-饮食相互作用对代谢和炎症的影响。作者将与 MRS 相关的 48 个细菌 pathway 与血浆水平的 12 种细胞因子和 78 个饮食因子进行系统整合分析。在校正年龄，性别和BMI后，12 个pathway 和 5 种细胞因子存有 14 种显著关联（图5）。这些关联很大程度上独立于 MRS，因为在调整 MRS 后依然显著。而且这些关联的细胞因子大部分是白细胞介素成员，例如：IL-10 有 8 种关联；IL-6 有 3 种关联；IL-12P70 有 1 种关联；IL-18bp有 1 种关联。这些白细胞介素成员水平升高与 CVD 的风险增加有关。

与这些白细胞介素相关的 pathway 是大部分是与细菌 AA 生物合成（脯氨酸，鸟氨酸，苏氨酸，瓜氨酸，酪氨酸，精氨酸），尽管 IL-10 和 IL-18bp 也与 GDP-甘露糖代谢糖酵解和同型乳酸发酵有关。

此外，细菌糖酵解 pathway（GLYCOYSIS） 与脂联素的血浆水平正相关，脂联素参与葡萄糖代谢调节，因此该发现提示宿主和肠道微生物组之间在糖代谢中可能的相互作用。

• MRS 与饮食的关联

我们已知饮食会影响代谢，CVD 风险和肠道微生物。在校正年龄，性别和 BMI 和吸烟后，78 个饮食因素中有 34 个与 MRS 相关的微生物通路相关（图5）。

与低 CVD 风险关联的 pathway 相关的饮食因素包括高摄入水果、蔬菜、坚果、鱼、茶和红酒以及富含蛋白质或无麸质的饮食。

与高 CVD 风险关联的 pathway 相关的饮食因素包括高摄入碳水化合物、脂肪、总热量、甜饮料、面包和乳制品摄入量。

作者逐步回归模型进一步评估了微生物与 MRS 的关联对饮食和炎症依赖程度，分析表明 48 个关联的 pathway  中的 43 个 pathway 是独立于饮食和炎症与 MRS 显著相关。

• MRS 与 SCFAs 的关联

MRS 与饮食关联发现，水果和蔬菜的摄入量与 48个 MRS 相关的 pathway 相关，对于这个现象可能的解释机制是细菌通过发酵膳食纤维产生 SCFAs 以影响 CVD。于是作者测定了粪便中 5 种 SCFAs 浓度，结果发现这 5 种 SCFAs 与大部分的 MRS 相关的 pathway 显著关联（图5），但是却与 MRS 没有显著关联，而且 SCFAs 与 pathway 的关联方向几乎与 MRS 与 pathway 的关联方向一致，这个现象先前报告研究提示的 SCFAs 有利于健康相悖。对此，作者解释可能原因是在肠道中产生的 95％ 的 SCFAs 被结肠细胞快速吸收，实际上只有 5％ 存在于粪便中，因此血浆 SCFAs 水平而不是粪便 SCFAs 水平与炎症和 CVD 风险相关。

进一步分析了血浆中的 SCFA 浓度最高的乙酸盐，正如预期一样，血浆乙酸盐的浓度与低 MRS 和 29 个 MRS 相关的 pathway 相关。

结论与讨论

① 该项研究从饮食，宏基因组，血浆代谢组，炎症因子和 SCFAs 多维度探究了 CVD 的肠道微生物组与血浆代谢物和代谢特征的关系，并且关注了肥胖人群中心血管病发生发展的代谢风险特征。但是本研究代谢主要关注于脂蛋白亚类和脂肪酸，更广泛的新陈代谢谱需要进一步研究。

② 校正年龄、性别、BMI和吸烟后，肠道微生物组可分别解释 LLD 队列和 300-OB 队列血浆代谢物的变异高达 11.1％ 和 16.4％。

③ 构建 MRS 评估肥胖人群中 CVD 代谢风险，特别发现了肥胖特异的微生物关联，特别是脂蛋白亚类 VLDL、IDL 和 LDL 的脂质组分。此外，由于饮食，遗传背景和环境暴露的差异都会影响肠道微生物组，因此，300-OB 队列中 TMAO 的结果与之前报道有些不吻合的可能原因是 300-OB 队列只是是肥胖的高龄荷兰人，他们血浆 TMAO 浓度均值为5.18μmol/ l，高于年轻人群或基于人群的队列。

④ 48个 pathway 与 MRS 相关，其中大多数涉及氨基酸、碳水化合物和多糖的代谢。

⑤ 本研究的 2 个队列都是荷兰人群，因此研究结果会受到遗传背景和地域的限制。

M菌 · 笔记

该研究使用的是 R 包 'glmnet' 的 LASSO 模型估算微生物因子解释的血浆代谢变化的比例

参考文献

[1] Kurilshikov A, van den Munckhof I C L, Chen L, et al. Gut Microbial Associations to Plasma Metabolites Linked to Cardiovascular Phenotypes and Risk: A Cross-Sectional Study[J]. Circulation research, 2019.

[2] Würtz P, Havulinna AS, Soininen P, et al. Metabolite profiling and cardiovascular event risk: A prospective study of 3 population-based cohorts. Circulation. 2015;131:774–785.

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撰稿 | 三明治    责编 | Bing

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