iHMP 第五弹 | 糖尿病前期的纵向多组学研究

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文献速递

为了更好理解早期 T2D ，本研究样本取自106 个健康个体（HC）和糖尿病前期个体（prediabetes），历经大概 4 年的时间，收集了转录组、蛋白子、细胞因子、蛋白组和宏基因组数据。大量的纵向数据揭示了以下观点：HC 的 profiles 在不同个体间是不同的。同时，个体内或个体间的变化是多种模式；在呼吸道感染和免疫期间，宿主和肠道微生物发生改变。免疫触发潜在的保护机制与呼吸道感染触发的机制不同。此外，在呼吸道感染期间，胰岛素耐受患者与胰岛素敏感患者的反应不同；数千个测得的分子的关联分析表明在胰岛素耐受（IR）和胰岛素敏感受试者（IS）体内存在特异的宿主-微生物相互作用；最后确定 T2D 发病前一个人的早期个人分子信号，包括免疫marker：白介素1 受体激动剂（IL-1RA）、高敏 C-反应蛋白（HSCRP）和异生素诱导的免疫信号。本研究揭示了在健康或疾病期间，葡萄糖失调和健康个体的通路和反应。提供开放的数据资源，可以进一步研究健康，糖尿病前期和 T2D。

Keywords: T2D, prediabetes, respiratory viral infections, immunization, insulin-resistant, insulin-sensitive

Title: Longitudinal multi-omics of host– microbe dynamics in prediabetes

DOI: 10.1038/s41586-019-1236-x

Journal: Nature [IF  43.07]

First Authors: Wenyu Zhou, M. reza Sailani, Kévin contrepois, Yanjiao Zhou, Sara Ahadi

Correspondence: George M. Weinstock, Michael Snyder

Affiliation: Department of Genetics, Stanford University School of Medicine, Stanford, CA, USA.

Published: 2019-05-29

研究背景

T2D，一种代谢疾病，影响全世界 4 亿人。糖尿病前期或中度高血糖人群有很大的风险发展为 T2D。糖尿病前期人群中每年大约有 15% 的人会患糖尿病，最终，70%的人会患糖尿病。通过胰岛素可以把糖尿病前期和 T2D 关联。高血糖个体也产生胰岛素，但对胰岛素没有响应。研究糖尿病前期和胰岛素耐受个体，可以探究糖尿病的早期状态，及其对生物反应和健康的影响。

糖尿病个体与健康人的宿主 marker 和肠道微生物组的信号不同。此外，生理压力（如：病毒感染）与糖尿病的发展相关。然而，当前研究缺乏一个全面且同步的宿主和微生物分子的 profile 。无法系统地理解健康个体和糖尿病前期个体在基线上的差异或随着时间的变化、以及对压力（如：病毒感染）的响应和这种响应是否依赖于胰岛素耐受状态。

为了更好的理解健康个体和 T2D 早期阶段个体的生物过程。本研究对具有多种血糖控制损伤（如胰岛素耐受）的个体做了详细的纵向分析。对肠道和鼻腔的微生物，健康或压力期间的血液进行研究。研究发现：健康状态下，许多宿主生化物质和微生物组成随着时间的变化而保持稳定，但在病毒感染或其他紊乱的情况下，这些物质和组分会发生动态的，明显的变化。值得注意的是，这些变化在 IR 和 IS 个体中不同。此外，此研究还提供了丰富的、开放获取的纵向数据资源，可以在个体水平上深入研究宿主和微生物的改变。

研究思路

图 1. 数据采集时间点以及类别

研究结果

1健康 baseline 的差异

研究对 106 名受试者（55 woman, 51 man；age 25-75；BMI 19-41）进行为期 4 年的随访调查。在各个随访点，都测了血红蛋白 AIC（糖化血红蛋白，diabetes ≧ 6.5%  > prediabetes ≧ 5.7%））。对 66 名没有禁忌症的受试者做 IST （胰岛素抑制测试），根据 SSPG（稳态血糖）发现 31 名是胰岛素敏感个体（IS，SSPG < 150 mg dl-1），35 个是胰岛素耐受个体（IR，SSPG ≧ 150 mg dl-1）。

IQRs （四分位差）和 ICC （组内相关系数）*结果显示，发现 clinical labs （临床实验室化验）和 cytokine （细胞因子）的个体间差异最大，而转录组的个体间和个体内有相似的差异。肠微生物种类比肠预测基因的个体间差异更大（P = 7.26*10-15, 图2 A）。

ind_score （个体分数）*结果显示，Clinal labs 的分离程度最高（ind_score = 0.165），transcripts 的分离程度最低（ind_score = 0.007）。

本研究还评估了时间对个体健康 baseline 变化的影响，强调随着时间的增加，单调增加或单调减少的 marker。确定随着时间的变化，宿主的分子和肠道微生物的物种显著相关，正相关或负相关。在随着时间增加而减少的 marker 中，有先前已报道的分子（如 碱性磷酸酶，ALKP13；q = 1.77*10-33）和未报道的分子（如：红细胞血红蛋白，MCH；q = 6.08*10-14）。同时，几个微生物属而随着时间减少，包括 Erysipelotrichaceae unclassified, Butyricicoccus 和 Akkermansia (q < 0.05)。

* IQRs （四分位差）描述多组学数据的分散程度。复杂多变的模式取决于组学类型、分析物的表达和受试者的结构。在每个多组学的分析物中，用 LMD （线性混合效应模型）计算 ICC （组内相关系数）来评估受试者结构可解释的变化的比例。

*ind_score （个体分数）定量个体间的分离模式。基于前 30 个最差异的分析物，显示分离模式（图1A）。选择的分析物越多，ind_score 越小。同时，由于每个组学的个体间分析物的差异，分离程度和 ind_score 不同。Clinal labs 的分离程度最高（ind_score = 0.165），transcripts 的分离程度最低（ind_score = 0.007）。

图 2. 健康状态下发现的差

2胰岛素耐受相关的因子

用 SSPG 值做回归分析以及 IS 和 IR 个体的共关联分析（ A1C、HSCRP 或其他临床指标）。结果显示，BMI 值一样时，每个受试者的 SSPG 之基本不变。矫正 BMI、age 和 sex 后，发现 85 个数据和临床数据与 SSPG 显著相关（图2 B, q < 0.1），其中 75 个在胰岛素耐受/敏感分类中再度发现。正如先前报道的，甘油三酯与 SSPG 正相关，而 HDL （高密度脂蛋白）与 SSPG 负相关。此外，临床试验测试发现中性粒细胞数（q = 0.028）和白细胞数（q = 0.066）与 SSPG 显著正相关，表明 SSPG 与增加的炎症和免疫反应有关。胰岛素耐受还和脂类物质的变化以及几种长链不饱和脂肪酸（与 SSPG 负相关）有关。与胰岛素耐受/胰岛素敏感分类负相关的代谢物，包括吲哚乙酸（q=0.13）和苯丙酰胺乙酸（q = 0.043），与代谢综合征负相关，是肠道微生物多样性的 marker。Blautia （与吲哚乙酸负相关）与 SSPG 正相关（q = 0.045），与报道中 Blautia 与糖耐量受损和糖尿病正相关一致。Odoribacter (q = 0.028)、 Oscillibacter (q = 0.011)、和Pseudoflavonifracter (q = 0.0007) 都与 SSPG 负相关，与先前研究发现的健康人的 Odoribacter 丰度高于非酒精性脂肪肝患者（多是胰岛素耐受）。

总之，胰岛素耐受与更高的免疫反应、脂代谢的变化相关，可能导致胰岛素耐受患者对其他应激压力反应受损。

3呼吸道病毒感染相关的通路

为了更好的理解在 RVI （呼吸道病毒感染）期间的变化，按时间分为 5 组：RVI 前的健康时间点（-H，首次 RVI 感染前少于 186 天），早期（EE，RVI 后 1-6 天），晚期（EL，RVI 后 7-14 天），康复期（RE，RVI 后 15-40 天）和 RVI 后的健康时间点（+H，离上次 RVI 少于 186 天）。AUC 分析确定在 RVI 期间，随着时间变化的健康基线（-H 和 +H）的差异表达分子。Paired t-tese 确定其他组间的变化（如 EE vs baseline）。基于 AUC 分析，发现 2,026 个转录本、11 个细胞因子、145 个代谢物、29 个蛋白、11 种肠道微生物、30 种鼻腔微生物以及 25 个临床检测数据，在 baseline 显著差异（q < 0.1）。基于转录本、蛋白质、细胞因子和代谢物，使用整合经典通路分析（ICPA），确定与防御反应（如：白介素信号通路，mTOR 信号以及 B 细胞和 T 细胞受体信号）有关（图 3A）。此外，在早期 RVI 阶段（EE），确定真核起始因子（eIF2）信号通路，eIF2 被 RVI 激活，调节促炎因子的表达。研究发现在 RVI 期间，未被报道的失调的分子通路（图 3A），包括：神经通路（如 亨廷顿舞蹈症，q = 7.7*10-5；轴突导向，q = 3.0*10-4；神经炎症信号，q = 5.0*10-2）；代谢通路（如 胰岛素受体通路，q = 9.1*10-3；肥胖中的瘦素信号，q = 2.9*10-2）；心肌肥大（q = 2.5*10-2）。总之，病毒感染改变了多条生物通路。

进一步研究发现 RVI 期间 4 个上调或下调的主要分子簇，及其最相关的通路，微生物组成和临床检测数据（图 3B）。研究发现：在 RVI 期间，HSCRP 和 白细胞数增加，HDL 减少；肠道中 Firmicutes 和 Odoribacter 减少（被报道在免疫和 RVI 期间减少），Ruminococcus、Barnesiella、Alistipes、Rikenellaceae 和 Bacilli 增加；鼻腔微生物也发生改变。

接下来，比较 IR 和 IS 的 RVI 反应。发现相较于IS，IR 在 RVI 后的发生的变化更少（基于AUC 分析确定 649 vs 873 显著差异的分子，q <0.05）。且在两组中，RVI 影响的通路不同（图 3C）。值得注意的是，在 IR 中，大多数免疫相关的通路在 EE 阶段富集，在 EL 阶段几乎没有和免疫相关的通路。一个主要的差异是急性期反应（可以触发非特异性机制来预防感染，一种快速的炎症反应）仅在 IS 的 EL 阶段被激活。在 RVI 期间，IR 被发现有更少的鼻腔微生物组成和预测的基因，这一发现与 IR 的宿主反应受损一致。RVI 期间，在 IS 中发现鼻腔中 Streptococcus 的丰度显著增加。同时，IS 的鼻腔微生物的丰富度和多样性都显著减少（q<0.05）。IR 在 RVI 感染期间的增加的炎症反应以及受损的免疫反应，可能会阻碍病菌和细菌的协调性。IR 和 IS 的肠道微生物组成的变化不同。

总之，研究结果强调在胰岛素耐受个体中，RVI 的发生可能会增加发展成代谢疾病（如 T2D）的风险，且这些个体有对 RVI 的响应的受损的免疫应答。

图 3. RVI 期间，不同相应的动态变化

4不同的免疫反应

在流行性感冒引发的免疫期间（VAC），确定 3,019 个转录本、9 个代谢物、6 个蛋白、6 个肠道微生物、15 个鼻腔微生物和 23 个临床检测数据显著差异（q<0.1，stage-wise test）。随着时间，差异表达的分子呈现了短暂的模式。尽管免疫反应和 RVI 之间的富集通路有些相似，但是有一些有很大差异（图 4A）。例如：整合经典通路分析确定的免疫通路（如 B 细胞受体信号和 NF-kβ 信号）在 RVI 和免疫反应中差异。此外，大多数通路相关的调节器（如 IFN γ、IL-2、IL-3、IL-6 和 BDNF）在 RVI 和 VAC 中差显著差异（q<0.05）。此外，在 VAC 中发现，T1D、T2D 和 胰岛素受体信号显著减少（q<0.05，图 4A）。这些发现与 RVI 的宿主反应形成对比，表明免疫反应可能减少 T1D 和 T2D 风险。在 RVI 和 VAC 中分别确定了 11 个和 6 个差异物种。在免疫诱导的变化中，Erysipelotrichaceae （与 肥胖和高脂摄入有关）减少，免疫与 T1D 和T2D 信号负相关（多种代谢疾病中存在）。这些数据显示 RVI 和 VAC 在分子通路方面有很大的差异，失调的通路（包括：免疫反应、代谢和精神通路）和失调的肠道以及鼻腔的微生物。

图 4. 免疫反应期间，多组学数据的变化

5压力事件分类的标签

进一步研究多组学数据区分压力事件的能力：健康和 RVI （图 4B）。多组学、代谢组、蛋白组和细胞因子可以很好的区分 RVI 和健康基线（88.6%、80.1%、77.1% 和 76.9% 的正确率；逻辑回归（LR）模型）。LR 模型和支持向量机（SVM）选择最具有预测特征的因子，包括：IP10（促炎细胞因子）、血清淀粉样蛋白 A1、未成熟的树突细胞、C12H19NO2（代谢物）、血清淀粉样蛋白 A2、EFEMP1、LYM（淋巴细胞）、GZMB（转录本）、尿刊酸、甜菜碱和 CD80（转录本）。此外，使用 LR 和 SVM 模型区分 VAC 和健康基线，发现多组学和代谢组 marker 有最高的准确率（73.2% 和 70.2%；LR 模型）。与单一组学相比，即使样本量很少，多组学数据在区分健康基线和压力事件有更好的作用。不同组学数据补充描述宿主身体状态发生改变时的分子过程。

6多组学分子关联

根据测量的宿主和微生物的数千个的多组学分子，研究确定了分子和通路的相关性以及 IR 和IS 个体的差异分子和通路。基于健康基线的两种水平解释相关性：个体水平个体内，LME 模型；图 5）和队列水平（矫正 BMI、age和sex），两种水平都可以提供不同的机制。个体水平的相关性分析，关注组学内的相关性，以及 IR 和 IS 的肠道微生物组和其他组学的差异。IR 和 IS 的相关性的数目没有显著差异。IS 和 IR 与肠道微生物之间的显著相关性（图 5A）。值得注意的是，在 IS 中发现，Holdemania （可能会促进癌症免疫疗法）和两个别的属（Clostridium.XlVb 和Phascolarctobacterium；q<0.05）显著相关；在 IR 中，Holdemania 与五个别的属（包括 Clostridium.XlVa, Clostridium.XVII 和Collinsella；q<0.05）显著相关。上述的独特的 IR 和 IS 的相关性显示两组的肠道微生物互作模式不同。

进一步研究了肠道微生物和宿主代谢物之间的相关性，IR 和 IS 的相关性的数目有差异。关于肠道微生物和宿主细胞因子的相关性，发现 5 个 IS 特有的相关性（q<0.05），如：Barnesiella 和 IL-1β 显著正相关（q = 0.0054），Faecalibacterium 和 TNFA 显著负相关（q=0.0244，图4B）。由于 Barnesiella 与 IL-1 激活以及 IFN-γ 信号相关，Faecalibacterium 和 TNF （可能与 IL-17 激活协同作用）相关，IR 中这些相关性的缺乏。表明胰岛素耐受可能影响肠道微生物和宿主细胞因子的相互作用。此外，仅在 IR 中发现，Butyricimonas 与四种脂质显著负相关（q<0.05），表明这种相关性与葡萄糖失调有关。

总之，上述发现表明：在 IR 和 IS 中，肠道微生物和宿主的免疫以及代谢属于协同变化。

图 5. 相关性网络捕获 IR 和 IS 的不同的多组学关联

7糖尿病个体的纵向跟踪

多组学数据的分析揭示个体异常值（图 6A）。如：个体（ZJTKAE3）有大量的异常转录本，通路富集分析发现这些富集在毒性通路，尤其是氧化应激和肝脏异常。在没有症状的情况下，这个个体也可能在分子水平上处于肝脏或相关的异常状态。事实上，这个个体五个月后被诊断为肝脏脂肪变性。

纵向分析个体（ZNED4XZ）发现与剩下的受试者相比，许多健康样本包括代谢物和细胞因子的异常值。在本研究对其的最后一次随访后的10个月被诊断为 T2D，研究数据显示其 T2D 发生的分子机制。在被检测出的免疫分子中，在其被确证为 T2D 前的三次的随访调查中，白介素 1 受体抗原（IL-1RA）和 HSCRP 都升高（图 6B）。值得注意的是，依据发展成 T2D 的受试者发现，有 262 个分子和 IL-1RA 的趋势相同（75 个和 HSCRP 相同）。在与 IL-1RA 高度相关的分子中，发现异生素信号，包括甲基尿酸和甲基黄嘌呤（与受损的葡萄糖耐受相关的肠道微生物的代谢物）。这些异生素和宿主因子（C4B、C4BPB 和 C4BPA）的表达、急性免疫反应的信号和LPS刺激的 MAPK通路（PAF1、PRKD3、MAP3K5 和 PIK3CD）相关，以上都和糖尿病的发生相关。此外，在确诊为 T2D 之前，研究还发现肠道微生物多样性减少和体重增加。因此，通过测量 T2D 发病前的多组学数据，可以鉴定疾病诊断之前就改变的分子。在个体中，这些分子与 T2D 发生潜在相关。

图 6. 纵向数据揭示 T2D 发病前的个体特征

结论与讨论

• 不同个体间的健康基线数据不同的。同时，个体内或个体间的变化是多种模式；

• 在 RVI 和 VAC 期间，宿主和肠道发生改变；

• VAC 触发的保护机制，与 RVI 触发的机制不同；

• 在 RVI 期间，IS 与 IR 的反应不同；

• 数千个分子的关联分析，表明在 IR 和 IS 的宿主-微生物相互作用不同；

• 确定 T2D 发病前一个人的早期个人分子信号，包括免疫标志物：白介素1 受体激动剂（IL-1RA）、高敏 C-反应蛋白（HSCRP）。

揭示了在健康或疾病期间，葡萄糖失调和健康个体的通路和反应；提供开放的数据资源，可以进一步研究健康，糖尿病前期和 T2D。

参考文献

Zhou, W. et al. Longitudinal multi-omics of host-microbe dynamics in prediabetes[J]. Nature 569, 663-671 (2019).

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撰稿 | Yanni    责编 |Yanni

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