iHMP 第一弹 | IBD 的超级无敌多组学研究
这是一项囊括了
粪便的宏基因组、宏转录组、蛋白组、代谢组、病毒组；
活检组织的人转录组、表观组和16S；
血液样本的人外显子组、血清检查和表观组。
超级无敌多组学研究，本文章侧重报道了肠道微生物的部分研究结果。
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文献速递
炎症性肠病（IBD）包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC），影响全世界数百万人。作为整合人类微生物组项目（HMP2或iHMP）的一部分，文章对 132 名受试者进行了为期一年的研究（每个最多 24 个时间点；总共 2,965 个粪便，活组织检查样本，和血液标本）。
文章发现患者微生态中兼性厌氧菌特征的升高是以专性厌氧菌为代价的，同时会影响生物转录过程和代谢产物中的分子降解，和宿主血清中的抗体含量。
疾病的周期可以被时间特异变量所标记，包括特异性的物种组成、功能和生化指标。
文章最终确定了这种失调中最核心的微生物、生化指标和宿主因素。
Keywords: IBD,iHMP
Title: Multi-omics of the gut microbial ecosystem in inflammatory bowel diseases
DOI: 10.1038/s41586-019-1237-9
Journal: Nature [IF 41.577]
First Authors: Jason Lloyd-Price
Correspondence: Curtis Huttenhower
Affiliation: Infectious Disease and Microbiome Program, Broad Institute of MIT and Harvard, Cambridge, MA, USA.
Published: 2019-05-30
研究背景
人类基因组中包括 200 多种 IBD 相关的风险变异因子，其中许多是宿主 - 微生物相互作用的结果
IBD 患者肠道微生物组的常见变化包括兼性厌氧菌（包括大肠杆菌）的增加，以及生产短链脂肪酸（SCFAs）的专性厌氧菌的减少
研究思路
五个研究人群：三个儿童人群（Cincinnati Children’s Hospital, Massachusetts General Hospital (MGH) Pediatrics, Emory University Hospital）、两个成人人群（MGH and Cedars-Sinai Medical Center），共 132 个研究对象（图1a）。
基于初始内窥镜和组织病理学未被诊断 IBD 的个体被归类为 “non-IBD” 对照。
共分析了在诊所收集的 651 个活检组织（base-line）和 529 个血液样本（大约每季度一次），以及 1,785 个粪便样本（每两周一次，持续一年）。
粪便样本：宏基因组（MGX），宏转录组（MTX），蛋白质组（MPX），代谢组（MBX）和病毒组（VX）（图1b）
活检组织：人 RNA 测序（RNA-seq（HTX）），表观组学（RRBS），16s
血液样本：人外显子测序，血清检验，RRBS
最终，得到了 305 个包含全部测量分析数据的结果，791 对 MGX-MTX 的结果（图1c）。
图 1. A）全部研究对象的分布情况；B）所有样本的收集情况，包括活检、粪便、血液等；C）不同测量数据之间的交叉情况；
研究结果
与先前研究一致，主坐标分析的第二主坐标更能区分 IBD 子集（图1d），但对于全部的测量数据，个体内的差异解释了大部分的方差（图1e,f）。大部分的测量数据在不同的样研究对象、横断面或者时间序列研究上都有相关性（图1e）。特别是从 MGX, MTX, 和 MPX得到的功能数据联系紧密。与预计不符的是，尽管收集了详尽的跨时间的饮食数据，饮食仅仅能解释 3% 研究对象间物种上的差异，和 0.7% 时间跨度上的差异。
图 1. D）所有样本的PcoA分析；E）Mantel tests量化的各因素对研究对象间和研究对象内方差的贡献度；F）PERMANOVA得到的各量化指标对研究对象内差异的贡献度
患者和对照之间最明显的差异出现在代谢组中（图1f，2a）。总体而言，患者的代谢组多样性低，与之前对微生物多样性的观察结果一致。可能是由于营养吸收不良、患者的肠道水分或血液过多、在活跃 IBD 患者中食物通过肠道时间较短等原因导致的。
粪便钙卫蛋白和 Harvey-Bradshaw 指数（HBI）是 CD 中评估严重程度的两个指标，在结果中没有显著相关性，而 UC 中的简单临床结肠炎活动指数（SCCAI）与粪便钙卫蛋白水平弱相关（图2b）。
与之前的研究相悖的是，在进行多项假设检验后，IBD 患者和对照组之间没有显著差异的宏基因组物种。文章认为这可能是因为参与研究的患者分化为两种，一种是不太活跃的 IBD（症状缓解或者最近才发生），另一种 IBD 则更为活跃。文章将与对照组差异非常大样本称为“失调”(dysbiotic)样本（图2c）。最终得到 78 个完整失调研究对象和 9 个部分失调研究对象，共 272 个失调样本，占全部样本的 17.1%。且失调持续的时间与发生失调的次数具有指数关系
根据失调的定义，失调时期在全部测量量中都导致了很大一部分差异（图1f）。这表明，随着时间的发展，在某些极端病人中，活跃的疾病状态和不活跃的疾病状态之间差异会越来越大。
与之前横断面研究一致，CD 的失调与不失调样本之间的差异比 UC 个体间更明显。
同时，失调与不失调在一些宿主的测量值有显著差异，例如血清中的 ASCA （抗酿酒酵母抗体），ANCA （抗中性粒细胞胞质抗体），OmpC （外膜蛋白C）和 CBir1 （抗鞭毛蛋白）。
同时，失调导致多样性降低。
图2. A）十种横断面分析中显著差异的代谢物含量在对照、UC、CD 组里的分布情况；B）CD 和UC 中评估疾病活跃度的指标之间的关系；微生物失调分数（microbial dysbiosis scores）的分布C）Bray–Curtis 相似性的中值D）与钙卫蛋白的关系E）持续时间（左）和间隔时间（右）在 UC 和 CD 中的 Kaplan–Meier 曲线；
在物种层面，失调导致了跟之前 IBD 横断面研究中观察到的相同的情况，例如
CD 中的专性厌氧菌降低，以及大肠杆菌等兼性厌氧菌的富集。
Ruminococcus torques 和 Ruminococcus gnavus 是 IBD 中的两个富集的物种，在失调的 CD 和 UC 中也分别显著差异。
在代谢组中：
SCFAs 通常在失调组中减少（图2f），特别是丁酸盐的减少与之前观察到的生产丁酸盐的菌的消耗是一致的，例如 F. prausnitzii 和 R. hominis（图2f）。
还检测到初级胆汁酸胆酸盐及其甘氨酸和牛磺酸结合物的富集，而次生胆汁酸石胆酸盐和脱氧胆酸盐在失调中减少，表明产生二级胆汁酸的细菌在 IBD 相关的生态失调中被耗尽，或者通过结肠的通过时间太短，这些化合物不能代谢。
微生物生态失调期间的这些显著的代谢组学差异与疾病期间预期的变化一致，提供了进一步的证据证明失调状态与 IBD 特别相关。
在生物化学上也发现了与失调相关的显著差异。以及一个表型尚不清楚的噬菌体与失调状态显著相关。
图2. F）显著差异的宏基因组物种、代谢物、转录产物在失调和非失调样本之间的差异
通过对时序宏基因组，宏转录组学和代谢组学数据的分析，每个受试者的微生物组倾向于随时间偏离基线（图3a）。对于 CD 和 UC 患者，在宏基因组数据的物种层面最为明显。宏转录组中的物种结果也有同样的趋势。而 KEGG 的注释结果、代谢组和蛋白组变化得要快很多，在最初两周内迅速变化后，与最后一个时间点情况相差很小。表明这些特征在肠道内迅速变化，且在发展过程中没有额外的剧烈变化。
图3. A）基于宏基因组物种丰度的时间点之间的Bray–Curtis 相似性结果
文章进一步想从连续时间点之间的移位（shifts）来确定肠道微生态长时间的变化。
移位的定义是在连续时间点变化中，人与人之间的 Bray–Curtis 相似性大于个人不同时间点的相似性。
在宏基因组分类学特征的结果中，找到了 166 这种移位（39 来自对照组，44 来自 UC，83 个来自 CD）。考虑到对照和患者不同的采样率，IBD 患者的移位发生率仅仅略高于对照组。
但是，相对丰度变化最大的物种在对照和 IBD 患者间显著差异（图3b）。
对照组中的移位主要发生在 Prevotella copri 中，在整个周期中丰度反复升高与降低（图3c）。在 IBD 患者中丰度不低且较为稳定。
图3. B）在移位中变化最大的 10 个物种在不同组别中的移位频率；C）P. copri 的相对丰度在三个组别中随时间的变化
同一方法应用于代谢组时，得到移位的发生率为宏基因组的一半。使用PERMANOVA 检验得到的相邻时间点的代谢组差异，这些差异大部分都是由未知化合物驱动的。其他的包括尿胆素（urobilin，主要在对照组中），尿酸盐（CD 组中）（图3d,e）。
图3. D）三组别的PCoA结果，以及对应的三种代谢物分布情况；E）尿酸盐含量在三个组别中随时间的变化；
将活检组织的分子测量结果（RNA-seq、甲基化等）纳入 IBD 微生物组分析后，发现影响分子测量结果的主要因素与影响微生物组的主要因素显著不同。影响肠上皮组织基因表达的主要因素是取样部位。因此，文章对每个活检取样部位进行了单独的微生物组和关联分析。
与对照样本比较，从发炎位置为回肠和直肠的样本中分别鉴定出了 305 个和 920 个差异表达基因（DEGs）。
这些基因中包括可直接影响共生微生物的基因，如 CXCL6（细胞膜破坏因子）和SAA2 （抑制革兰氏阴性菌的生长），以及间接影响微生物的 DUOX2（产生活性氧）和 LCN2 （通过隔离诱导微生物铁缺失）（图4b）。
对 DEGs 的 KEGG 注释结果进行通路富集，其中免疫相关通路的结果很明显。特别是 IL-17 信号通路在回肠和直肠中富含上调的 DEGs（图4a），其组成部分先前被发现存在于 CD 患者的回肠活检样本的基因表达谱中。在来自 UC 患者的直肠活检中上调的 DEGs 中，发现补体级联（complement cascade）的富集，这是先天免疫的一个组成部分，与 IBD 有关。
进一步，对活检组织进行了 16s 分析，确定哪些物种与这些 DEGs 相关。分别在回肠和直肠中鉴定出了与上述基因相关的 31 个和 106 个没有重复的 OTU。涉及基因包括已知的 IBD 相关宿主 - 微生物相互作用因子，
包括 DUOX2 及其成熟因子 DUOXA2，两者都与回肠中的 Ruminococcaceae UCG 005（OTU 89）的丰度呈负相关。
几种被报道有抗菌作用的趋化基因（CXCL6，CCL20），与回肠中 Eubacterium（OTU 120）和直肠的链球菌 Streptococcus（OTU 37）和 Eikenella（OTU 39）的相对丰度呈负相关。
最后，参与试验的人群并不是为遗传关联分析设计的，但其中 92 个受试者都进行了外显子测序，未来可以与其他群体进行整合分析。
利用下列十种测量数据构建关联网络搜索 IBD 相关的因子间的相互作用：宏基因组种水平结果，种水平转录率，EC 基因家族水平的功能丰度（MGX，MTX和MPX），代谢组，宿主转录组（回肠和直肠），血清学和粪便钙卫蛋白含量。
首先，使用相同的混合效应模型（或适当时的线性模型）对每种测量类型计算残差，以确定差异丰度。得到的残差用来最小化个体间的差异，因而凸显跨时间的人群内的相互作用。
最终得到的网络含有 53,161 个有效边，2,916 个节点，并筛选出每个测量量中至少一端节点与失调相关的 p 值最小的 300 个边进行可视化（图4c）。
来自粪便的 5 个测量量的代表在网络中被作为分线器（hubs,定义为至少有 20 个边相连的节点），且都与失调相关。
其中与分类学相关的有 F. prausnitzii 和 Subdoligranulum 的未被分类的一支。F. prausnitzii 与在失调中下调的许多 EC 的表达显著关联。
而大肠杆菌则与在失调中上调的许多 EC 的表达显著关联。
Acylcarnitines（酰基肉碱）和胆汁酸作为生物化学上的大分类在网络中也出于突出地位，属于这两分类的部分化学物质在失调期间变化。
另外还有例如 SCFA 丙酸盐、抗 OmpC 的抗体等生化指标以及三个宿主上的基因的回肠表达量在网络中出于突出位置。
图4. A）在回肠和直肠样本中，人的差异表达基因，以及与表型和免疫通路的对应关系；B）宿主-微生物交互作用中相关的4个基因在不同组别和取样部位中的表达量情况；C）十种测量量的显著关联网络
M菌 · 笔记
本研究作为作为 HMP2 的一部分，研究涉及的数据和方法都可以在 IBDMDB 中获取（https://ibdmdb.org/）
研究者依据 IBD 症状活跃程度再将每个亚型（UC 和 CD）细分成 2 个亚组（一组是不太活跃的 IBD （症状缓解或者最近才发生），另一组更为活跃 IBD，失调组）
本研究的一些新发现：
在疾病期间由梭菌引起的更大的基因表达；
IBD 的个体中相对丰富的 P. copri 意外具有稳定性；
除了短链脂肪酸和胆汁酸之外，大量的酰基肉碱失调有可能成为治疗 IBD 的新靶点。
有待研究的问题：
代谢物的改变是由宿主还是微生物组驱动的；
尚未确定找到这些生物特征是否能在疾病发生之前预测疾病事件；
IBD 疾病时间轴变化有待深入探讨。
参考文献
Lloyd-Price J, Arze C, Ananthakrishnan A N, et al. Multi-omics of the gut microbial ecosystem in inflammatory bowel diseases[J]. Nature, 2019, 569(7758): 655.
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撰稿 | J 责编 | NSC
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