基因编辑工具分享（一） | sgRNA脱靶预测线上工具Cas-Offinder

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凭借设计简单、高效和低成本，CRISPR/Cas9系统是目前基因编辑的热门工具。CRISPR/Cas9系统主要包括两个元件：Cas9核酸内切酶和向导RNA（sgRNA）。其中，sgRNA能够识别靶DNA序列中保守的前间区序列邻近基序（Protospacer Adjacent Motifs，PAM），通过与Cas9蛋白结合，引导Cas9核酸内切酶定点切割靶向DNA。但如果sgRNA与基因组上其它位置即非靶序列结合，便会引起脱靶效应。因此，如何设计高效、特异性的sgRNA，预测其脱靶效应是科学界关注的焦点。

今天，舒桐科技小编给大家介绍一款用于sgRNA脱靶预测的线上工具Cas-Offinder (http://www.rgenome.net/cas-offinder/) ，并附带了详细的操作教程，赶紧点个关注吧！

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Cas-Offinder简介

Cas-Offinder ^[1]是由韩国首尔国立大学Kim团队研发的一款用于sgRNA脱靶预测的工具。Cas-Offinder的工作原理是：

1）用户提供on-target sgRNA的PAM序列、长度和物种信息；

2）Cas-Offinder在全基因组范围内，筛选与on-target sgRNA具有相同PAM和长度的序列；

3）将找到序列与on-target sgRNA进行比对，计算mismatch、insertion和deletion信息；

4）根据用户输入的阈值信息（mismatch、insertion和deletion）筛选符合条件的序列（off-target）输出。

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Cas-Offinder操作

 2.1  Cas-Offinder输入

Cas-Offinder需要用户提供六个信息：

1）PAM序列类型；

2）物种；

3）待预测的sgRNA序列；

4）off-target允许最大错配数；

5）off-target允许最大插入(DNA隆起)长度；

6）off-target允许最大缺失(RNA隆起)长度。

网站包含了常见的一些PAM序列类型和物种，如有特殊需求，可以联系网站作者添加或者下载Cas-Offinder代码，用命令行执行。

2.2 Cas-Offinder输出

Cas-Offinder预测结果，主要用两个表格展示：结果汇总表和详细表。

Cas-Offinder预测脱靶，不受PAM序列限制，允许DNA发生多个mismatch、insertion和deletion，通用性强，十分实用。但是Cas-Offinder仅给出了可能发生脱靶的位置，对于该位置发生脱靶的概率还是未知。

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FrCas9介绍

珠海舒桐医疗科技有限公司深耕基因编辑技术10余年，是一家以基因编辑为核心技术的生物医药服务企业，可承接脱靶检测、细胞株定制、病毒包装等CRO及CDMO业务。近日，由舒桐科技研发团队经数年潜心研发的“一种2型CRISPR/Cas9基因编辑系统及其应用”成功通过俄罗斯发明专利申请，获得联邦知识产权局授权，并取得“授予发明专利权通知书”。本项专利CRISPR-FrCas9是目前已知的切割效率最强、脱靶效应最低、特异性最好、PAM限制最少的CRISPR，显著优于SpCas9，极大程度保证了基因治疗的安全性及有效性。目前，FrCas9已被Cas-Offinder收录，方便研究者进行脱靶预测。

FrCas9产品优势

1、切割效率高：在NGTA PAM下，其切割效率高于SpCas9；

2、脱靶效应低：脱靶效应极低，甚至低于不同种类的高保真型SpCas9；

3、提供sgRNA设计服务及质粒构建服务；

4、专利授权费低于SpCas9，可进行授权合作。

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参考文献

[1] Bae S., Park J., & Kim J.-S. Cas-OFFinder: A fast and versatile algorithm that searches for potential off-target sites of Cas9 RNA-guided endonucleases. Bioinformatics 30, 1473-1475 (2014).