【期刊】浙江大学郝翔研究团队：4Pi荧光超分辨显微术综述

本文选自中国工程院院刊《Engineering》2022年第4期，原文出自：Review of 4Pi Fluorescence Nanoscopy

引言

自20世纪90年代以来，持续的科技进步突破了光学显微镜的衍射极限，使三维超分辨显微成像技术得以实现。回顾这些历程，一个重要的里程碑是基于两个对置物镜的4Pi显微架构及其超分辨版本的出现。鉴于此，浙江大学郝翔研究团队综述了4Pi超分辨显微术的近期进展。总体上，4Pi超分辨显微镜为透明样品观测提供了一种能够突破衍射极限、非侵入、各向同性的三维分辨率的技术手段。具体而言，本研究针对目标开关和随机开关两个主要4Pi超分辨显微术版本，讨论了它们的架构、原理、应用和未来发展趋势。

自1873年研究人员推导出衍射极限以来，光学显微镜的分辨率在接下来的一个多世纪中未能取得根本性突破。然而，对于高分辨率的追求从来就没有停止。最终，经过不懈努力，科学家在20世纪90年代取得突破。由于衍射极限的存在，可见光波段范围内的显微镜分辨率一直被限制在250 nm以内。超分辨显微术的出现使得人类终于打破这一桎梏。得益于过去20年超分辨显微术的进步，现阶段已经可以实现在xy平面和沿z轴将分辨率分别提升6~10倍。需要强调的是，超分辨显微术并非特指某项技术，而是若干种不同技术方案的总称。但是，无论具体实现方式如何，这些技术在本质上是相通的：各种技术都由光强调制，并且非线性地开关荧光染料分子以实现对荧光辐射的操控，继而在时间上依次记录整个观察区域内的细节。正是由于这些技术能够提供突破衍射极限的分辨率，才使首次使用光学显微镜进行许多生命科学研究成为可能。

由于大部分生物结构都具备三维空间分布，因此，将超分辨率成像扩展至三维水平，可以清晰地显示这些生物体结构或记录分子运动。将原有的二维超分辨显微成像扩展至三维水平有多种技术实现路径。对于单分子定位显微术（SMLM），如光激活定位显微术（PALM）、随机光学重构显微术、荧光激活定位显微术（fPALM）而言，可以采用双焦面成像或者点扩散函数（PSF）操控的方法；对于以受激发射损耗显微术（STED）、可逆饱和光学荧光跃迁显微术为代表的目标开关超分辨显微术而言，最常用的策略则是同时使用两个相位板，通过非相干叠加的方式来创造一个三维中空的STED/可逆饱和荧光跃迁（RESOLFT）聚焦光斑。

通过以上两种技术路径都可以在理论上获得无限小的分辨率。然而，在这些不受衍射极限限制的技术中，光的衍射现象实质上仍然发挥作用。然而，无论使用哪种技术，最终能达的分辨率仍然取决于显微镜聚焦光斑的锐利程度。这一事实导致的后果便是：相对而言，轴向分辨率的提高比横向（焦平面内）分辨率的提高更加困难。因此，即使通过超分辨显微术可以将横向分辨率提升到20~40 nm，但是同一架构下达到的轴向分辨率仍然比横向分辨率低（后者约是前者的2.5倍）。

相对而言，各向同性的三维分辨率受到更多青睐；因为各向同性的三维分辨率能够提供更加自然的视野，并且基于这样的图像进行数据分析，得到的结果也更加精确。然而，由于使用单个透镜只能覆盖半个球面波波前，除非刻意牺牲横向分辨率，否则要做到三维各向同性是非常困难的。另外，如果存在一个光学系统，能够收集焦面之后的另外半个球面波波前，由于对称性的恢复，系统PSF的形状就可以（基本上）保持为一个球形。基于上述思想，在20世纪90年代早期，部分研究人员发明了基于两个对置物镜的4Pi显微镜。在实际应用中，一个物镜大约只可以覆盖65°的半孔径角，使用两个物镜则可以几乎完整覆盖整个4 π的立体角（实际应该为2.5 π~3 π）。如图1所示，在4Pi显微术中，逆向传播的两束相干照明光分别经过两个对置物镜在共焦面上聚焦，并产生叠加干涉条纹的PSF。这种实现方式被称为A型4Pi架构。另一种实现方式，即B型4Pi架构，则通过对置物镜反向收集荧光信号并让它们在探测器上发生干涉。

图1. 4Pi显微镜的简化架构与原理示意图。（a）简化架构示意图。（b）在轴向平面（xz平面）内的4Pi显微镜PSF。上下两个物镜的PSF相干叠加压缩了整个PSF的轴向尺寸。（c）不同4Pi架构的有效PSF。从左至右：A型架构，激发光相干；B型架构，发射光（荧光）相干；C型架构，两者同时相干。APD：雪崩光电二极管；BS：50/50分光镜；DM：二向色镜；L：透镜；M：反射镜；SM：扫描镜。

由于引入了共焦面附近的干涉，上述两种方式都可以在轴向上显著压缩PSF的尺寸——这也是构成扫描型4Pi显微镜的基础。如果只保证激发光（A型4Pi架构）或荧光（B型4Pi架构）相干，则可以将轴向分辨率提高3~4倍。如果同时使激发光和荧光相干（C型4Pi架构），则可以将轴向分辨率提高约7倍。除此之外，由于4Pi架构可以从两个方向收集荧光，可收集的荧光光子数可翻倍，最终可以提高图像的信噪比（SNR）。与之类似，非相干干涉照明图像干涉显微术可以被理解为是4Pi显微术基于相机的宽视场版本：包含两个对置物镜，在焦面附近采用驻波干涉作为照明，并以相干的方式收集荧光信号。因此，它的分辨率也与4Pi显微镜类似。

在本研究中，浙江大学郝翔研究团队对4Pi荧光超分辨显微术进行了综述，图2给出了4Pi显微术的技术演进路线。现阶段，大多数超分辨显微术已有能力提供50~100 nm的空间分辨率。然而，如果空间分辨率能够在此基础上进一步提升一个数量级，那么生物学家就有望能直接观察大型分子复合体内的单个分子基团的三维图像。如果这一梦想得以实现，生物学家就可以对细胞内的分子机制进行原位成像，观察其结构和分子组成。这种能力对于许多的生物学研究至关重要，例如，在这样的分辨率下可以对DNA构象进行三维观察，以理解染色体DNA的包装和基因调控。在现阶段，为了具备这种能力，理论上可以通过在随机开关纳米显微镜中，将单个荧光发射器的光子数量增加两阶，或在靶向开关超分辨显微镜中将STED激光衰减功率提升两个数量级。然而，如此高剂量地增加光子数或激光强度，通常不利于实际的生物实验。相比之下，如果基于双物镜4Pi而非单物镜架构，相同超分辨显微术在轴向的分辨率几乎可以提高3~10倍。在此基础上，进一步将分辨率提高一个数量级，而且不需要满足荧光标记的严格特性或苛刻的成像条件。

图2. 4Pi显微术技术发展路线图。

由于各类不同的4Pi超分辨显微术已经实现，相关的理论体系亦已建立完备，下一阶段的研究重点将是如何使得相关技术以更好地解决实际的科学问题。不难理解，如果要发挥4Pi双对置物镜架构的最大效能，观察样品必须是完全透明的。为了在整个成像过程中保持稳定的干涉模式，4Pi显微镜对由样品折射率不均匀引起的像差很敏感。尽管已有少量关于4Pi显微镜被用于细胞学研究的报道，但是相关技术在厚样品的应用还几乎完全没有被研究，如生物组织方面。为了实现4Pi显微术在生物组织中的应用，需要解决样品像差问题。因此，必须首先建立一个用于描述像4Pi这类具有多个非连续圆形入瞳的显微镜像差的数学模型。同时，还需要在系统中引入自适应光学用于对样品像差的补偿。相关的理论已经启发了一些将4Pi显微术用于全细胞和组织切片样品成像的前瞻性工作。虽然致力于将4Pi显微术用于厚样品成像的研究工作已经开始，但其全部潜力还远未被发掘。在这个进程当中尤为关键的一步则是如何将4Pi显微术运用到活体样品成像中。

关键词：荧光超分辨显微术；超分辨成像；4Pi超分辨显微术；isoSTED；4Pi-SMLM

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原文链接：http://www.engineering.org.cn/ch/10.1016/j.eng.2020.07.028

以上内容来自：Xiang Hao, Yiming Li, Shuang Fu, Yanghui Li, Yingke Xu, Cuifang Kuang, Xu Liu. Review of 4Pi Fluorescence Nanoscopy [J]. Engineering, 2022, 11(4): 146-153.

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