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【课后加油站】做Western blot 如何正确选用内参抗体？
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为什么别人的Western blot做起来很简单？
而我总遇到做不出结果、假阳性、多条带···
到底是一抗有问题还是二抗有问题傻傻分不清……
其实，作为有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应不象1+1那么明确，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的 Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。
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什么是内参？
Western Blot 试验中的标准（表达量）参照物即内参，有了参照物才能准确地比较目的蛋白表达量的差异。内参一般选用管家基因表达的蛋白，它们在各个组织细胞中表达相对恒定，不会因为外部条件变化而引起表达量的变化。而且内参可以监测整个试验体系是否正常，比如蛋白提取过程，转膜体系，显色体系等。
02
为什么要使用内参？
在 WB 开始之前，常使用生物化学测定法（例如 Bradford，BCA 等）测定样品中的蛋白总量，确保在各孔加入等量蛋白。内参可帮助确认所有样品是否都已上样，各个孔的电泳是否正常工作，内参信号的分析也可鉴别出蛋白在 WB 实验中转膜的均一性。
此外，大多数杂志要求 WB 结果中有内参数据，只有当各孔之间的内参蛋白表达量相当时，在目标蛋白上观察到的改变才被认为是可靠的。
03
如何归一化WB结果？
WB 可用于蛋白半定量，需要将数据归一化（normalize）来比较多个样品目标蛋白的相对表达。具体方法如下：
通过灰度值分析测定每个蛋白的条带强度； 目标蛋白的条带强度除以内参的条带强度，以减少样品间变化的影响； 比较所有泳道上目标蛋白的相对表达量以评估样品中目标蛋白表达的变化。
04
选择内参抗体考虑的因素
✦ 分子大小
内参蛋白分子大小（kDa）的选择非常重要，与目标蛋白相比，内参蛋白应该要足够大或足够小，以便与目标蛋白区分。如果目标蛋白和内参蛋白大小相当的话，WB 结果无法直接观察，很难进行准确数据的分析。
✦ 线性范围及上样量
线性范围是条带强度与膜上目标蛋白表达成比例的区域，过高或过低的上样量都会产生误差。很多情况下，目的蛋白的表达量相较于内参来说非常低，常常需要加大上样量，但是，这时内参表达量就会超出线性范围。超载的凝胶，在所有的泳道上表现出相同的条带强度，这种检测无疑是不准确的。
因此，推荐先确定样本的线性范围，可稀释样本来创建标准曲线。根据标准曲线来鉴定饱和点和所需的总蛋白量。
✦ 表达强度及稳定性
确保选择的内参在样品中高表达。大多数常用的内参蛋白是由保守基因高表达的，这些保守基因是细胞发育及维持细胞活力所必须的（即看家基因）。
此外，还应该选择表达不受实验变量影响的内参。最佳的内参应当不受样本来源（如正常和疾病样本）、实验条件的影响。例如，GAPDH 不适用于氧相关研究，因为缺氧可能上调 GAPDH 的表达。
✦ 样本种属来源
选择内参首先要考虑的就是实验样本来源于什么物种。哺乳动物的组织或者细胞样本，通常选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Na+/K+-ATPase, Histone H3等。植物来源实验样本，则可以选择Plant actin、Rubisco等。其他来源样本研究较少，所以就应该参照文献报导，选择合适的蛋白作为内参。
✦ 目的蛋白分子量
选择内参抗体时，应该考虑目的蛋白分子量的大小。通常应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5KD以上。比如检测目的蛋白分子量为45KD，此时不适宜选择β-actin（42KD）作为内参，可以考虑选择GAPDH（36KD）作为内参。
✦ 目的蛋白表达部位
就一般的蛋白检测来说，β-actin、β-Tubulin抗体等就可以了，而针对于核蛋白的定量，特别是样本蛋白就是核蛋白时，选择恰当的核蛋白内参则更能体现内部参照的价值。常用的核内参抗体有Lamin A、Lamin B、Histone H3，除此之外，其它常见的核蛋白内参还有PCNA、K70、K80等，在一些文献报道中，Erk2、TATA binding protein(TBP)以及c-Jun、c-Fos等都有使用。而对于膜蛋白检测，常用的内参抗体为Na,K ATPase。对于线粒体蛋白的检测，常用VDAC1和COX IV作为内参抗体。
04
常用内参抗体
Actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。
Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，其余两种广泛分布于各种组织中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的50%。
但是在一些少量特殊的情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成，分子量大小为42KD左右。
✦ Tubulin
Tubulin即微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白。
Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体，是形成微管的最主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin实际检测条带均在55kDa左右。
作为内参，β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。
✦ GAPDH
GAPDH即甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是参与糖酵解的一种关键酶，催化糖酵解的第六步,它还参与核转录等事件,核糖核酸转录、DNA复制和修复以及细胞凋亡。由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。
GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western Blotting的内参。请注意,某些生理因素,如缺氧和糖尿病,会增加GAPDH在特定的细胞和组织的表达。
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