荧光定量PCR入门必备知识点全攻略

一、基本定义

索引：基线、荧光域值、Ct值、标准曲线、效率、溶解曲线、荧光染料荧光定量PCR（realtime PCR）检测，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。荧光定量PCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点，到21世纪初已得到广泛应用。1. 基线的定义和设定基线（Baseline）指在PCR扩增反应的最初数个循环里，荧光信号变化不大，接近一条直线，这样的直线即基线。基线确定应考虑足够的循环数，消除扩增早期的背景，但应排除扩增信号开始超过背景的循环。2. 荧光域值（threshold）和设定一般情况下，PCR反应的前15个循环的荧光信号作为荧光本底信号，实时荧光定量 PCR 反应的阈值信号水平较计算出的基线信号水平有显著增加，荧光域值的缺省设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。3. Ct值（阈值循环）C代表Cycle，t代表threshold（阈值，临界值），Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。研究表明，每个模板的Ct值与该模板的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代Ct值。因此，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 4. 标准曲线利用连续稀释的已知样本建立标准曲线，确定实验样本的目的模板起始量，或者评估反应效率。以已知的连续稀释浓度的对数为横坐标 (x 轴)，该浓度对应的 Ct 值为纵坐标 (y 轴)，绘制曲线。
5. 相关系数 (R2)相关系数可用于表示数据与标准曲线之间的契合度。R2 值反映了标准曲线的线性度。在理论上，R2 = 1，但0.999 一般为最大值。6. Y-截距y-截距表示反应的理论最低检测限，或者 x 轴上的最低拷贝数的靶分子产生明显扩增时的预期 Ct 值。7. 斜率扩增反应的对数线性期的斜率可用于检测反应效率。8. 效率理论上，PCR 反应的效率应为100%，表示在指数扩增阶段每次热循环后的模板倍增。实际效率可提供反应相关的重要信息。诸如扩增片段的长度、二级结构和 GC 含量等实验因素会影响效率。影响效率的其它条件有反应本身的动态范围、使用的试剂浓度未达到最佳以及酶的质量，这些因素均会导致效率低于90%。一种或多种试剂中存在的 PCR 抑制剂可使其效率超过110%。良好的反应效率应在90%至110% 之间，PCR扩增效率是指多聚酶把各种试剂（dNTP，寡核苷酸和模版cDNA）转变生成扩增子的效率。每个循环扩增子的最大增量为两倍即代表PCR反应的效率是100%。检测PCR反应的扩增效率非常重要，因为扩增效率可反映人为原因引起的荧光定量PCR(qPCR/RT-PCR)问题。低扩增效率（<90%）可能由于Tag酶抑制剂的污染，过高或未优化的退火温度，时间较久或已失活的Tag酶，引物设计不合理或扩增子含二级结构。过高反应效率（>105%）一般是由于引物二聚体或非特异性扩增。而引起过高或过低的反应效率最常见的原因包括移液器不准或不当的移液操作技术。9. 熔解曲线 (解离曲线)在RT-PCR进行时，随着反应温度的升高，当结合染料分子的双链 DNA (dsDNA) 解离或“熔解”成单链 DNA (ssDNA)时，荧光强度会发生显著的变化，从而构成了一幅溶解曲线图。不同的PCR产物溶解曲线特性不一样，例如目的扩增产物与引物二聚体的溶解温度不一样，通过扩增后熔解曲线分析，可以简单、直接地检查实时荧光定量 PCR 反应中是否存在引物二聚体的干扰，确保反应的特异性。要进行熔解曲线分析，应对实时荧光定量 PCR 仪进行编程，在RT-PCR实验结束后重新设置一个新溶解曲线的新程序，仪器将重新加热扩增产物，为您提供完整的熔解曲线数据，根据样品孔和阴性对照孔的溶解曲线判断是否存在非特异性扩增情况。10. 荧光染料荧光定量PCR所常用的荧光化学材料可分为两种：荧光探针和荧光染料。1)TaqMan荧光探针：PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。而新型TaqMan-MGB探针使该技术既可进行基因定量分析，又可分析基因突变（SNP），有望成为基因诊断和个体化用药分析的首选技术平台。2)SYBR荧光染料：在PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料非特异性地掺入DNA双链后，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。常用荧光基团：磺酰罗丹明（Texas Red）、异硫氰酸荧光素（FITC）、羟基荧光素（FAM）、四氯荧光素（TET）、（JOE）、（VIC）、（ROX）、（NED）

二、实验操作及注意事项

实验程序设置详见“6-荧光定量PCR基本操作与注意事项”和“10-ABI7500 TaqMan qPCR设置教程”注意事项1.良好的实验技术2.模板浓度和纯度3.RT-PCR引物设计原则和注意事项4.一步法和两步法RT-PCR（RNA的RT-PCR）5.内源性对照和外源性对照

三、结果分析

病原检测实验结果的考评标准1.是否为显著的‘S型’扩增曲线2.扩增曲线的‘高度’3.阳性对照Ct值是否成立4.阴性对照是否报告Ct值绝对定量实验结果考评标准（详见各1-10参考文档）实验成立的软件界面图（选择样本，调整阈值，点分析按钮进行分析）1. 原始荧光组分曲线图（Multicomponent plot） 2. 扩增曲线图（Amplification plot） 3. 原始多通道荧光信号（Raw data plot） 4. 质控报告（QC summary） 质控包括出现如图所示的感叹号时，应在对应的质控报告中找到出现此符号的具体错误信息，并根据相应的信息进行设置或者重新实验。5. 理想的实验结果为：以上四项均处于下图的正常状态

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