答曰：顺利的话从头到尾也不会超过一周。
但是在“顺利”之前要经历些什么是只有做过的人才知道的暗无天日想几个月前，刚开始构建质粒，当时以为容易的很，于是单枪匹马雄赳赳气昂昂的进行，从引物设计、PCR扩增目的基因、酶切、连接、转化到最后挑单克隆提质粒去测序，6666到不行直到.....测序结果出来，这TM全是假阳性啊，我呵呵了感觉心脏骤停，于是之后的几个月开始排除各种问题，在连接不上和假阳性的边缘旋转跳跃卒……最后的最后，排除重重大BUG、小细节，终于在两周内把我的十几个质粒构建好，主要用的还是双酶切和同源重组的方法，下面是实验室小菜鸟是如何作死之双酶切法篇。
引物设计前，我们需要了解质粒的序列和图谱。以pLVX-Puro为例，我们最需要了解的有：酶切位点、标签以及抗性。1、酶切位点选择启动子后面的MCS区的酶切位点，需要确认的有（1）酶切位点在质粒上是单酶切.（2）在目的基因上不能有所选择的酶切位点.（3）为了避免载体自连要确保两个酶切位点产生的黏性末端不能互补。（4）两个酶切位点不能离的太近，至少不小于5bp，隔得远一点质粒酶切的时候效果更好。如图质粒我选择的就是实验室最常用的Xhol和EcoR I两个酶切位点。2、根据需要选择带各类标签的载体。如果载体上不带蛋白标签，并且你需要的标签比较小（比如HA tag，只有十几bp）可以直接通过引物把标签连到载体上。3、抗性，主要有氨苄抗性和卡那抗性，小心别用错抗生素啦，不然当然啥也长不出来啦 了解了这些之后，可以设计引物了，根据个人喜好选择一款引物设计软件，嗯，我用的是Vector NTI。设计引物时，在目的基因引物的5’端加上酶切位点，重头戏来了！！！！你以为加上酶切位点就完事儿了吗？知道保护碱基怎么加要加几个够用不？不加保护碱基后果很严重！做个比喻，如果你的目的基因是根筷子，那么从中间掰肯定容易掰断，但是你从一端掰就难的多，所以加保护碱基的目的就是为了让限制酶工作的时候“省力”。事实上，关于要加几个保护碱基才能省力，查查你限制酶官网的说明书就知道啦其他的，引物长度一般在16bp-30bp，加长其实也没事，最长的我试过50-60bp;GC%一般50%左右，最好不要超过40%-60%这个范围，不然引物很可能结合不上去啦（其实我在迫不得已的情况试过70%GC，最后没毛病，建议不要轻易尝试，发生什么不好的事儿别怪我，哦呵呵呵），另外正反引物GC差不超过10%；Tm值，50-70℃，正反引物Tm差也不超过10℃，如果Tm值比较高，建议可以使用退火温度和延伸温度一样的PCR程序，具体的感兴趣可以私聊~酶切有两步，一个是载体的酶切，一个是目的基因的酶切。首先载体酶切，如果你的载体是空载，并且两个酶切位点比较近，那么建议单酶切回收在后再单酶切，而且酶切之后通过电泳你是鉴别不了你是否切开了的，只能在涂板后验证如果你的两个限制酶的最佳工作温度不一样，也建议单酶切+单酶切，保证两个酶都能高效作用。个人不太喜欢空载，喜欢用之前别人连了外源基因的载体，这样切下来之后跑电泳的时候就可以清晰的看到两条带了，一条线性载体的带，一条切下来的外源基因的带，切没切开一目了然。
然后是目的基因的酶切，你会发现酶切前后条带没什么差别，毕竟只切了一个碱基，不过没关系，你只要确保你的目的基因大小正确，之前设计引物保护碱基也没问题就ok啦~连接，个人喜欢4℃过夜，如果第二天也忙，过两夜也没问题。连接体系很重要，目的基因和线性载体一定要严格按照比例添加，其实这个只要你认真阅读连接酶的说明书就会看到。举个例子，如果目的基因800bp，线性载体8000bp，那么按物质的量来算，连接体系中目的基因最好是加线性载体的10倍。比如一个10ul的连接体系，需要0.03pM的线性载体+0.3pM的目的基因。其他，比如连接酶不能剧烈震荡，连接体系加好不要有气泡，这些都是需要注意的。总之，记得好好看说明书，这样才能心里有底。多少个清晨醒来，面对空空荡荡的转化板，我的心也空空荡荡的我能怎么办，当然是要坚强，找到元凶破案是关键！转化步骤大家都很清楚，但是你知道要做哪些对照吗？对照一定要做，不然就找不到做不出来的原因啦以下对照一定一定要做1、阳性对照：如果用的是空载的质粒就直接拿完整的空载环状质粒做对照，这样可以鉴别培养基抗性是否准确，转染过程是否存在问题。如果用的是之前别人插入外源基因的质粒，那么回收的时候把线性载体和外源基因都回收下来，然后再用回收的片段去连接，这样不仅可以排除抗性和转染操作的问题，还可以检验你的连接酶是否正常。如果酶切后连接原片段都连接不上，估计该换链接酶啦2、阴性对照：将回收后的线性载体加连接酶做转化，看是否有菌落。如果菌落比较多，那么可能是单酶切之后自连了。（不做阴性对照的后果就是----假阳性 所以重要性不必多说了吧！）总结：正常情况菌落数量：阳性对照>实验组>阴性对照，其中阳性对照一般特别多菌落，实验组至少要十几个，阴性对照基本没有菌落，最多不超过5个。当你挑了单克隆之后，为了省力（qian），可以做一个菌液PCR，用目的基因的引物去扩增质粒，如果扩增出目的带就恭喜你啦~如果是假阳性，请往上仔细看看自己是否都注意到了各种小细节呢注意到以上这些小细节了嘛，如果都注意到了相信你一定可以成功勾出质粒走上人生巅峰哈哈哈哈哈，本篇就分享到这里，有补充的欢迎联系交流哦~最后的最后，祝各位都实验顺利头发茂盛~