【1分钟学实验】│细胞凋亡检测试剂盒可不只有Annexin V-FITC！

细胞调亡是细胞主动死亡的过程，并出现一系列特征变化。包括核固缩、核碎裂、凋亡小体形成，以及DNA特征性片段化、新的基因表达和特定的生物大分子合成等。

流式细胞仪可以对不同细胞凋亡的过程进行定性和定量检测，通过检测细胞膜完整性来反应细胞凋亡是最常用的流式检测细胞凋亡常用方法之一。

其原理是：

①用Annexin V检测早期凋亡细胞：Annexin V可以结合细胞膜上的磷酯酰丝氨酸，磷酯酰丝氨酸位于正常细胞膜内侧，不会被检测到，凋亡时外翻到细胞膜外表面，可以被检测到。

②用PI或者7AAD检测晚期凋亡细胞：早期凋亡的细胞，未丧失细胞膜选择通透性，PI/7AAD无法进入，晚期凋亡的细胞，失去细胞膜选择通透性，PI/7AAD可以对细胞核进行染色。但由于Annexin V本身没有荧光，因此需要偶联荧光基团，以便被流式细胞仪检测，通常会偶联FITC、eGFP、AF488、APC等基团。

细胞凋亡检测试剂盒一般会将偶联不同荧光基团的Annexin V与PI和7AAD任意组合。面对这么多试剂盒，我们该如何选择呢？

如果细胞没有自发荧光，可以选择最常用的红绿组合的试剂盒，比如Annexin V-FITC/PI或者Annexin V-eGFP/PI。这类试剂盒由于只需要488 nm激光器，并且荧光光谱重叠较小，对实验人员的技术要求相对较低，所以应用非常广泛。

其荧光光谱如下：

如果细胞本身需要检测绿色荧光，则应该避开FITC、eGFP等绿色荧光，可以选择Annexin V-APC/PI或者Annexin V-APC/7AAD组合的试剂盒。由于APC和PI的荧光光谱有较大重叠，因此对检测仪器和技术人员有较高要求，初学者通常需要仔细询问相关技术人员方可开展实验。他们的荧光光谱如下：

如果细胞本身需要检测红色荧光，则应确认红色荧光的激发光和发射光波长，如果与PI和7AAD的激发光和发射光均相似，则不能用这类试剂盒检测该细胞的凋亡。如果激发光或者发射光与PI或者7AAD有较大差异，则要具体情况具体分析，以荧光光谱重叠最小为原则进行试剂盒的选择。

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