生物小白的入门必修课——Western Blot之跑胶

‍一、实验背景知识

1.何为凝胶电泳：

    凝胶电泳可用于分离复杂的蛋白质混合物、研究蛋白质的亚单位组成以及证明蛋白质的均一性等，还能纯化出蛋白质用于后续的研究工作。在聚丙烯酰胺凝胶电泳中，凝胶孔径及蛋白质的电荷、大小、形状决定了蛋白质的迁移率。

2.凝胶电泳的基础物理知识：

    初中物理中，我们了解过欧姆定律：U=IR。在电泳中，电源提供了电压U，凝胶提供了电阻R。在我们现常用的商用电泳设备中，电源的红色常标记阳极（＋），黑色常标记阴极（-）。电源的红色阳极连接到电泳槽的红色接口，进一步连通至下缓冲液槽；电源的黑色阴极连接至电泳槽的黑色接口，进一步连通至上缓冲液槽。

    我们前文蛋白制样使用的SDS上样缓冲液为阴离子系统，其令我们的蛋白样本带上负电。于是，在我们的凝胶中，凝胶上缘连接电源负极，下缘连接正极，于是蛋白自上缘上样孔加样后，在电场作用下，以一定速度向下缘移动。

    大多数情况下，WB的电泳是在恒流条件下进行的，在电泳的过程中，凝胶的电阻会逐渐增大，根据U=IR，我们观测到的电源电压也会随着电泳过程的推移，逐步增加。

    电泳设备最多可以同时支持4块胶同时电泳，这4块胶是以并联的形式连接于电路中，因此，日常我们用于跑2块胶使用的电流，应当在跑4块胶时翻倍。

二、实验准备阶段

1. 玻璃器皿、耗材：
   1L 容量瓶与烧杯、100ml容量瓶与烧杯、100ml量筒、PVDF膜。 
2. 药品：
   Tris、SDS、丙烯酰胺（Acrylamide）、过硫酸铵（AP）、甲叉双丙烯酰胺、甘氨酸（Glycine）、盐酸、Tween-20
   
3. 需要的仪器：
   电泳仪、离心机、制冰机（制冰机记得要提前开启制冰）等。
   
4. 液体的配制：

• SDS电泳缓冲液（5×）：15.1g Tris碱（0.125mol/L），72g甘氨酸（0.96mol/L），5g SDS（0.5% m/v）配制成1L。
• 转膜液：Tris碱3.0334g + 甘氨酸14.4167g+甲醇150ml，三蒸水定容至1L。现用现配。
• TBS（10×）：Tris碱12.11g，NaCl=87.66g，调节PH至7.6，定容1L。
• TBST（洗膜缓冲液）：Tween-20加1ml，10× TBS 加100ml，补水定容至1L
  
• 5%脱脂牛奶（封闭液）：脱脂奶粉5g，使用TBST溶至100ml。

二、开始电泳

    配制电泳液，并组装电泳槽。如图，注意边缘封闭。组装时，应当避免暴力。

    上电泳槽补满电泳液，确认组装良好，没有漏电泳液。电泳液泄露，可造成电泳装置短路。

    稳定且垂直拔下梳子，避免把上样槽推歪。

    对着光线，能够清晰看到上样槽。

    化开蛋白样本，准备好marker，算好上样量。通常我们选择上样N=40 ~60μg，根据先前的蛋白浓度C，我们可以计算出上样量V=N/C。通常上样量介于8~15μl之间，最大不要超过20μl。当然，如果样本浓度差异不大，有些课题组也会选择所有样本均上样10μl，最终用目的蛋白与内参蛋白的灰度值相比以求得相对表达量。

    蛋白样本化开后混匀，离心（12000g，4℃，10min），取上清进行上样。此时，可以提前配上或是提前从负二十冰箱中取出并化开封闭液（脱脂牛奶）了。

    样本准备好了之后，就可以依据上样量进行上样了。

    首先marker上样，根据marker质量，上样6~8μl即可。

    依次蛋白样本上样。

    通电，恒流20mA。观察电路是否形成回路，电压是否合适，电泳液内电极丝处是否有气泡随电流上浮。20mA对应电压一般为50~60+V，若数值太大，说明电泳液或者胶有异样。

    等蛋白跑到浓缩胶外，进入到分离胶中，且条带整齐呈一直线时，调大电流至30mA，此时对应电压120~130V左右。（大约20min左右及进入分离胶；或当marker稍分出条带时）。

    电泳跑至近半时，可以开始配制转膜液了。配方常见前述，每两块胶需要1L转膜液。

    转膜液配制完成后，可以开始准备PVDF膜了，此处强调需要新手套，避免引入外源性蛋白。常用PVDF膜尺寸为6×8cm，PVDF膜较贵，可根据实际情况缩小裁膜大小。PVDF膜使用甲醇提前打湿，以活化。

    跑胶至足够分离开目的蛋白后，即可中止电泳，准备转膜。

    组装转膜装置。使用转膜液，提前打湿海绵。

    将转膜的架子拿出来，放入盛有转膜液的盘子中，黑上白下，依次放置两块海绵（靠近膜跟胶的海绵避免有太多毛球，海绵厚度适度，太薄则易滑脱）。加转膜液，液体恰好没过海绵即可（转膜液不要放太多，否则会使海绵及膜片漂浮，不好操作）。海绵上方亦可铺上一张滤纸，令表面更为光滑。每层海绵或是滤纸之间，避免产生气泡而出现转膜时不均匀。滤纸上方为PVDF膜，注意避免折叠或是损伤PVDF膜。

    用胶板将玻璃拨开，注意不要弄碎薄玻璃板。切去浓缩胶部分。

    将胶（仍贴在大玻璃板上）放入转膜液中，贴于膜上，膜和胶的亲和力很好，可用胶板轻轻分离胶和玻璃板，注意避免膜与胶之间气泡产生，注意排尽气泡。（黑上白下，黑色为负极，白色为正极，蛋白从负极跑向正极，因此胶靠近黑板，PVDF膜靠近白板。）

    胶上再盖一层滤纸，滤纸上再盖两层海绵。

    闭合转膜盒，避免黑白盖子错开，因此需要用手辅助固定。夹子滑脱后，胶可能扭曲，最终蛋白条带将糊开。

    将板子放在转膜盒中（黑对黑），冰袋放入盒子，转膜液倒至4Gels，先泡15min（让转膜液中和电泳时胶里的电荷），整盒冰浴。

    时间到了之后，恒压100V转膜，定时60min。

    转膜完成后，见效果良好。

    至此，实验尚未结束，之后PVDF膜还需要封闭，裁膜，孵育一抗、二抗，最后曝光。

    预知后事如何，且听下回分解。

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