生物小白的入门必修课——基础配液

【本文提要】

    细胞用液体的配液前准备

    细胞培养基的配液

    常见其他液体的配方：D-Hanks、PBS、多聚甲醛、胰酶、含钙镁的Hanks、棕榈酸

    酸缸的配制

---

    据我了解，一般人对做实验的认知，常停留在“烧钱”这一表面现象上。因此，很多新入组的、从未做过科研的小朋友们，常常也会怀有自己课题组十分富有的错误认知。事实上，极少有课题组能够做到经费自由。

    既然不是每一个课题组都有足够充足的经费来购买成品试剂，那么，配液就成了每个新同学进入实验室后需要学会的第一件事情了。

    本次教程将以培养基和细胞用平衡盐溶液为主要示例，概述配液的基本过程。文末并将附上其他常用液体配方。

【细胞用液体的配液前准备】

    第一天，耗时约2~3h：

    我们所有给细胞使用的液体，都需要使用洁净级别最高的容器来盛放。因此，所有的玻璃器皿，都需要经过泡酸的过程。

    将所用的玻璃瓶超声清洗30min（超声用水添加少量洗涤液，洗涤液不宜过多，以免超声产生大量气泡）。超声清洗完成后，流动自来水洗净洗涤液。继而超纯水简单涮洗一遍后，90℃烘箱烘干（约30min）。

    烘干完成后，温度较高，谨防烫伤。取出玻璃瓶，室温降温。待玻璃瓶降温至室温后，泡酸过夜，或泡酸8小时以上。

    此处强调，泡酸与捞酸过程均为危险操作，务必做好防护！

    第二天，耗时约7~8h：

    上午八点，选择合适的滤器（如本课题组，为一巨大的金属滤器）、1L容量瓶、1L烧杯、400ml烧杯，超声清洗30min，流动水冲洗干净（至少10遍，彻底洗去），超纯水再冲洗。

    泡酸容器取出，超声上述器皿的同时，可清洗泡酸器皿。使用流动自来水反复冲洗20遍，去除残留的酸；超纯水冲洗8遍，确保烘干后不留水垢。

    清洗完成后，将玻璃容器移入烘干机烘干80℃，烘干30~60min。

    继续完成滤器、烧杯等的清洗。待超声完成后，自来水冲洗20遍，超纯水冲洗8遍。烘干。烘干后观察，各器皿锃光瓦亮，没有水垢。

    所有器皿烘干后，准备高压滤器跟玻璃瓶。玻璃瓶瓶口拧松半圈（高压灭菌时，避免瓶内外压力差过大而发生爆裂），牛皮纸包裹瓶口。所有待高压物品用包布包裹。

    高压锅灭菌。通常灭菌程序为121℃，高压30min。使用高压锅前务必经过培训。所有的高压容器均需要谨慎对待。高压灭菌锅升温至121℃后，方才开始30min的倒计时，加上高压结束后的降温降压过程，共耗时约90~120min。高压灭菌结束后，及时取出物品并烘干。检查仪器并断开电源。

【细胞培养基的配液】

    按照前述方案准备好相应物品。

    以Gibco粉末培养基为例：

    于1L烧杯中加入三蒸水600~800ml（不能超过800ml）。自4℃冰箱取培养基粉末，加入烧杯，并用少量三蒸水冲洗袋内残留粉末。依据袋子上说明书，加入所需NaHCO3量（或参照本课题组经验数据，DMEM加入3.7g NaHCO3、1640加入2.2g NaHCO3）。加入双抗（使工作浓度达到100U/ml）。加入转子搅拌，烧杯封上保鲜膜，继续搅拌混匀。

    搅拌一定时长后，将液体补至800ml，定PH至7.2~7.4（7.2为佳）；使用移液枪转移HCl & Na(OH)2调pH；定PH后，液体移至1L容量瓶定容；转子继续搅拌一定时间；

    过滤除菌。

【常见其他液体的配方】 

    1.D-Hanks：

    精确称量氯化钠8.00g、氯化钾0.40g、七水合磷酸氢二钠0.09g、磷酸二氢钾0.06g、碳酸氢纳0.35g以及D葡萄糖1.00g；

    将上述化学物置入1000mL烧杯中，先加入800mL去离子水并放置于磁力搅拌器上进行搅拌溶解；检测D-Hanks液的酸碱度，并精确调整pH值至7.2，定容至1000mL。

    定性滤纸过滤，并分装于储液瓶中，高温高压灭菌后，置于4℃冰箱过夜，观察确认无结晶析出后使用。

     2.PBS：

    精确称量氯化钠8.00g、氯化钾0.20g、磷酸氢二钠1.44g和磷酸二氢钾0.24g；

    将上述化学物置入1000mL烧杯中，先加入800mL去离子水并放置于磁力搅拌器上进行搅拌溶解；检测D-Hanks液的酸碱度，并精确调整pH值至7.2，定容至1000mL。

    定性滤纸过滤，并分装于储液瓶中，高温高压灭菌后，置于4℃冰箱过夜，观察确认无结晶析出后使用。

    PBS与D-Hanks的一个重要区别，即PBS不含糖。

    3. 3.7%多聚甲醛：

    提前超声清洗小烧杯、100ml容量瓶、转子。

    精确称量3.70g多聚甲醛粉末，加入60ml PBS溶液。

    磁力搅拌器搅拌，期间加入氢氧化钠助溶。（需要大量氢氧化钠，加入后可明显看到悬浊液变澄清）。调PH至7.2~7.4。常规滤纸过滤，分装，4℃保存。

    4.胰酶

    无菌D-Hanks溶液，至少100ml，提前4℃预冷。（此处强调是D-Hanks，因为D-Hanks较PBS而言更为粘稠，配出来的胰酶效果更佳。此处还要强调尽管之后还要过滤，但配液使用的液体仍然需要无菌，否则之后过滤的液体仍大概率污染，小编也不知道为什么。）

    每100ml，添加胰酶粉末0.25g，EDTA0.02g。调PH=8.0~8.1。过滤后即可使用。

    5.含钙、镁的Hanks

    6.棕榈酸（10mM）的配液：

    A液配制(100mM NaOH 10ml)：称取0.04gNaOH溶于10ml D-Hanks中。

    B液配制（100mM棕榈酸）：称取0.0256g×1.1=0.02816g棕榈酸粉末，倒入EP尖管，加入1×1.1ml A液，使用较薄的海绵飘子，80度水浴加热（约20min，视环境温度而异），直至液体澄清。

    C液配置(8%无脂肪酸BSA溶液)：称取0.4g BSA溶于D-Hanks液2.5~3ml中，配制两管，55度水浴震荡5min（可使用60度孵箱水浴，反复震荡，不用担心起过多气泡）。再分别取0.5ml B液加入其中，55度水浴震荡5min（方法同前）。

    调PH：用D-Hanks溶液配置的NaOH溶液，使用PH试纸将PH调至7.2~7.4。注意，记住调PH时用的NaOH液体量V，D-Hanks补足（1ml-V）。此时，棕榈酸终浓度为10mM。

    灭菌：于超净台内过滤，分装于EP管，-20保存，避免反复冻融。

    PS：棕榈酸配液一般不用HCl调PH，且使用PH试纸调PH，因为HCl会使棕榈酸不溶，且因配液量较小，PH计电极伸不进去。

【酸缸的配制】

    材料：重铬酸钾6 000 g、浓硫酸10000 mL、蒸馏水50 000 mL、石棉网及支架、玻璃棒、酒精灯、手套围裙白大褂

    步骤：

    (1) 将重铬酸钾放人大烧杯中，加入蒸馏水放在石棉网上加热至沸腾并搅拌，使重铬酸钾充分溶解。

    (2) 将重铬酸钾液倒入酸缸中，然后缓慢加入硫酸并用一长玻璃棒不断搅拌，充分混合溶解。操作时务必注意安全，穿戴好耐酸手套和围裙，防止洗液溅到皮肤和衣物上。万一不慎溅到皮肤上应立即用大量清水冲洗，及时就医。

---

结束分割线

利益声明：

    本教程未涉及任何商业推广，所用试剂、耗材可根据各课题组需求酌情更换。

---

动动小手加星标，浏览文章不迷路！关注菌菌🍄
每天轻轻松松学生物，幸福喜乐阖家欢~


往期推荐

关注我们

点了“在看”的小哥哥小姐姐

永远帅气美丽可爱迷人😗