药物研发|中国间充质干细胞药物开发流程
间充质干/基质细胞（Mesenchymal Stem/Stromal Cells，MSCs）具有自我更新、高度可塑性、分化能力、免疫应答和免疫调节等诸多优点，在再生医学领域具有广阔应用前景。从临床级 MSCs 产品的开发到新药临床试验（IND），许多生物公司都投入了巨大努力。国家药品监督管理局（NMPA）已经实施了关于 MSCs 产品临床应用的规定。
近年来，国内对MSCs产品作为药物管理的规定进行了更新。文章重点关注 MSCs 产品开发过程中的流程和面临的监管挑战，目标是为满足监管需求提供策略。
一、间充质干细胞基本情况
目前，人们越来越需要了解MSCs作为药品开发相关的法规问题。 大多数MSCs产品，符合2006年国际细胞治疗协会（ISCT）定义的MSCs的最小标准，包括细胞表面标记物（即CD105, CD73，CD90）的高表达， 与造血细胞相关的标记物（如CD45、CD34、CD14、CD19和HLA-DR）的低表达，以及三系分化潜能。细胞标记物在描述给定适应证的MSCs细胞产物时缺乏特异性。尽管，世界上多数监管机构并不要求将纯化的 MSCs作为临床产品，但在MSCs产品开发过程中考虑细胞标记物时，需要确定一致性和纯度。
在美国，根据《公共卫生服务法》（PHS Act; 42 U.S.C. 262）第351条规定，经培养扩增的MSCs产品需要向FDA提交IND申请，获得许可开展临床试验。在欧盟，基于MSCs 的治疗产品开发和授权由欧洲药品管理局（EMA）监管。EMA成立了高级治疗委员会（CAT），负责MSCs治疗产品的审评和许可。在中国，根据现行监管法规，在临床研究中使用MSCs可通过两种途径获得许可。其一，卫健委已经实施了细胞治疗产品开展临床研究的相关法规，批准通过伦理委员会审查合格的指定医院，进行MSCs临床研究。其二，如果申办者打算开发MSCs药物，则使用MSCs产品的临床试验需要根据NMPA法规获得CDE规定的IND申请并获得许可。IND申请必须由申请人提交，并提供全面的信息（包括细胞和制造工艺的开发、质量标准、质量控制、MSCs产品的稳定性研究、药效研究、安全性和毒性研究以及临床试验计划和试验方案）。根据IND申报的规定，MSCs产品必须在符合GMP实验室生产。
本文，有助于MSCs产品开发者熟悉获得 IND申请许可的流程和监管问题。
二、间充质干细胞产品开发流程
三、适用于间充质干细胞产品的法规和指南
所有供人使用药品的开发都要求生物技术公司符合必须遵守的法律要求。
在美国，MSCs和其他细胞药物属于FDA生物制品评估和研究中心（CBER），特别是细胞组织和基因治疗办公室（OCTGT）的监管，该办公室依据CFR标题21第1271部分对人类细胞、组织、细胞和基于组织的产品进行监管。
在欧盟，MSCs 和其他细胞药物属于先进疗法药品（ATMP）的职权范围，包括体细胞治疗药物、基因治疗药物和组织工程产品。
在日本，自 2014 年以来，人类细胞、基因或组织来源的医疗药品一直受到《药品和医疗器械法案》（PMD法案）的监管。
在中国，最早以《中华人民共和国药品管理法》为指导，1984年全国人民代表大会首次颁布，2019年进行修订。随后，NMPA根据本法成立。NMPA 负责制定药品质量标准、药品管理法规、安全监督和管理。NMPA建立了药物审评中心（CDE），用于药物审查和评估。中国所有的细胞治疗（包括干细胞产品、免疫细胞产品和基因修饰细胞产品），均可参考NMPA在2017年出台的《细胞治疗产品研究与评价技术指导原则（试行）》规范。
2020年4月26日，NMPA更新了《药品生产质量管理规范（GMP）》的生物制品附录。NMPA还起草了《药品生产质量管理规范（GMP）》（征求意见稿）中的细胞治疗产品附录。2020年8月4日，NMPA还起草了《人源性干细胞及其衍生细胞治疗产品临床试验技术指导原则（征求意见稿）》。新药开发，也必须遵循现行《中国药典》和其他国家药品标准。此外，2017年，NMPA加入国际人用药品注册技术协调会（ICH），为新的成员，ICH 发布的所有指南都将得到NMPA的批准。
因此，药物研发企业可以参考ICH的指南。有关细胞治疗的更多可参考美国FDA，欧盟 EMA ，美国注射剂协会（PDA），美国的人体细胞组织优良操作规范（GTP），以及国际制药工程学会（ISPE）的相关法规和指导文件。
四、化学、制造和控制（CMC）
质控体系的建立与实施
GMP是一个质量保证体系，用于确保MSCs产品的持续生产和控制在适合临床使用的最先进的质量标准。因此，临床级MSCs应遵循GMP指南，按照IND法规和质量要求生产药品。GMP原则是为了给消费者和患者提供一致质量和高安全水平的产品。为了满足这些原则，制造商必须建立、实施和维护药品质量体系。药品质量体系应监督所有活动（从原材料进厂的控制、生产、测试、人员、设备、标识、生产记录审查、错误检测和纠正，以及产品最终放行授权）。确定并实施适当的产品质量改进、工艺改进、可变性降低、创新和药品质量体系改进，提高持续满足药品质量的管理能力，质量风险管理有助于确定和优先考虑需要持续改进的方向。
临床级MSCs产品的制造依赖于训练有素且符合岗位要求的员工，这是GMP质量体系的重要组成部分。国内GMP的期望是涉及生产和管理各个方面的员工将接受系统的教育、持续的培训和定期考核，并且负责人应具有具体职责和充分的授权以履行各自职责。此外，《药品生产质量管理规范（GMP）》的附录《细胞治疗产品（征求意见稿）》对包括产品生产负责人、质量负责人和质量受权人在内的关键员工提出了更高、更详细的资格要求。
MSCs产品生产环境和设施的空气清洁度水平应与产品和生产操作相适应，生产环境和设施不得对原材料、中间体和成品造成污染。MSCs产品的生产环境和设施应易于、有效清洁和消毒。此外，MSCs产品的生产环境和设施必须持续监测。MSCs产品的生产环境和设施的清洁、消毒、维护和监测操作必须进行定期验证和持续受制。生产设备的设计、定位和维护应符合其预期的目的和用途。生产、测量、称重、记录和控制设备应通过适当的方法和合格的机构在规定的时间间隔内进行维护、校准和检查。
CDE主要通过申请人的文件系统获得GMP合规性。这必须涉及操作和质量管理的所有方面，以便能够对一系列与产品制造和质量控制相关的所有活动执行审核。此外，《药品 GMP》（2010年修订）第8章指出，文件是质量保证体系的基本要素，生产商必须有书面的管理程序、质量标准、技术指南、制剂处方和工艺规程、标准操作程序和内容正确的记录。企业应建立管理和操作程序的文件管理程序，系统设计、编制、审核、批准和发布文件。质量管理部门应对与本规范相关的文件进行审核。文件内容应与药品生产许可证和药品注册的相关要求一致，并有助于追溯每批产品的历史记录。
物料管理
物料是指用于制造 MSCs产品的原料或材料（包括细胞、平衡盐溶液、蛋白酶、血清、培养基、细胞因子、各种添加剂、冷冻保存试剂、转基因材料、辅料、培养瓶、细胞冷冻保存袋等）。生产物料与MSCs产品的质量直接相关，因此，物料管理必须基于良好和标准化的质量保证和评估体系（包括风险评估、关键材料制造商和供应商的资格审核、质量放行测试的开发和改进等）。物料的来源、成份、使用、用量和质量控制应清晰合理。在选择材料时，应考虑必要性、合理性和安全性，并开展工艺去除效果验证和安全风险评估，必要时应对材料残留进行测试放行。优先使用已被批准用于人类或符合药典标准的材料非常重要。对于生物来源材料（如FBS和人白蛋白），应进行全面的外源因子检查，并在技术开发中考虑新外源因子的知识。使用自体细胞治疗产品应严格防止外源因子扩散的可能风险，材料管理的信息应在 IND应用程序的CMC部分提供，CDE评审员将确定制造的适用性。
·原料
用于分离和培养 MSC 的生物材料均来自供者，并需要签署了医院医学研究伦理委员会批准的知情同意书。每个供者都要进行人源病原体的筛查和检测，尤其是 HIV、HBV 和 HCV的检测，所有用于培养扩增所需的起始材料和试剂都需要进行检测，以便证明材料是无菌和无内毒素的。
细胞分离和培养扩增过程应在GMP条件下开展，并经验证以建立主细胞库（MCB）。质量控制需要同时实施，确保存储在主细胞库的细胞已经进行了无菌、支原体和内毒素检查和监测。因此，还要制定明确的规范和要求（如细胞表面标记物、优化培养条件、细胞传代数、生长特性等）。原则上，对于从适合建立主细胞库的生物材料中分离原代细胞，并有计划进行细胞检测、保存和制造。细胞库的水平可为根据细胞自身特点、生产状况和临床应用综合考虑建立细胞库检验标准，检验应满足安全性、质量可控性和/或有效性的基本要求。
·辅料
MSCs产品中辅料的使用、剂量和质量应该经过开发和验证，以证明其使用的必要性、安全性和合理性，并建议优先选择已批准可用于人类药品的辅料，否则，辅料的选用需要进行全面的研究和评估，另外，一个更好的选择是在产品 IND 申请审评过程中对关键辅料进行关联审评审批。
·容器和封闭系统
为了避免因储存而导致产品质量发生意外变化，生产商应在MSCs产品生产过程中对用于样品储存和/或成品的包装容器和封闭系统进行安全评估和相容性研究。为了说明其包装容器和封闭系统使用的合理性，还应进行其密封性研究和冷冻储存适用性研究。MSCs产品的生产过程（如采集的组织或细胞、制备过程中的细胞、成品的输注等）可能涉及样品与容器之间短期直接接触的步骤，生产商同样应在接触式容器系统和MSCs产品之间进行安全评估和相容性研究。此外，建议在IND审评过程中对直接接触药品的容器和封闭系统进行关联审评审批。
GMP车间的CMC
由于细胞具有在体内存活、自发增殖或/和分化的能力，其临床研究和质量控制应充分考虑上述基本特征，而MSCs产品应符合药品质量管理的一般要求。临床样品的整个制造过程合理，符合《药品生产质量管理规范（GMP）》的基本原则和相关要求，在生产过程和质量控制中应特别注意人员、环境、设备等要求。MSCs产品的制造应建立全过程或全生命周期质量保证和控制体系，生产过程应进行严格的工艺验证，并建立明确的关键控制点。应严格控制生产用材料，并建立和验证MSCs产品生产现场的标准操作流程，以避免生产过程中原材料和生产可能受到外部污染或交叉污染。还应采取有效的隔离措施，防止混淆来自不同供者或不同预期用途的产品。
·制造
MSCs产品的生产过程，是指从供者材料获得细胞到完成细胞输入到受者体内的体外操作过程。生产商必须进行工艺开发和验证，以证明工艺的可行性和可靠性。生产过程中的每一个步骤都需要加以控制，以确保成品符合包括规格在内的所有质量属性。
工艺验证，被定义为从工艺设计阶段到商业化生产的数据收集和评估，它建立工艺能够持续交付高质量的产品的科学证据。工艺验证包括MSCs产品和工艺生命周期内发生的一系列活动。工艺设计应避免细胞发生非预期或异常变化，并满足消除相关杂质的要求。建立技术标准、工艺标准操作规程、关键工艺控制参数、内控指标和废弃物标准，对整个生产过程进行监控十分必要。生产商应继续优化生产工艺，减少物理、化学或生物效应对细胞特性的非预想效果，并减少杂质（如蛋白酶、核酸酶和选择性抑制剂的使用）。如果制造过程中存在不连续生产，则应制定并验证细胞的储存条件和持续时间。建议采用封闭或半封闭制备工艺，以降低污染和交叉污染的风险。
整个生产过程的监控，包括关键工艺参数（CPP）监测和过程控制指标实现。生产商应根据对整个过程的了解和产品积累经验的基础上，明确过程控制中的关键生产步骤，制定敏感参数的限定范围，以避免过程漂移。必要时，还可以对生产过程中的细胞进行质量控制。生产过程中的质量控制和细胞放行检测相互结合和互补，以实现对整个过程和产品质量的控制。由于供体材料的多样性，可能含有传染病病原体，且过程可能造成污染。在 MSCs产品的整个制造过程中，应特别注意防止微生物污染。
MSCs产品的剂型、处方和处方工艺应根据临床用药要求和MSCs产品的稳定性来确定。某些MSCs产品在给药前，需要经历产品成分物理状态的转变、容器的转换、过滤和清洗、与其它组织材料的结合以及药物剂量的调整等步骤。因此，还应开发和验证这些工艺步骤，并在实际产品生产和应用中严格执行。应提供有关MSCs生产所用组份和材料的制造信息，以及对这些材料进行的检测汇，应提供制造过程中使用的所有组份的清单。对于异基因细胞，有关供体筛选和检测的信息应表明所有供体均符合供体标准，MSCs组织来源和分离、大规模扩增和收集培养必须要详细说明。细胞库部分应提供有关历史、来源、衍生和特性的信息（包括确定细胞安全性、特性、纯度和稳定性的检测）。
IND申请时，细胞生产过程中使用的所有试剂信息必须列明（包括基础培养基、细胞因子、生长因子、抗生素、胎牛血清、缓冲液和蛋白酶等）。这些试剂可能会对最终产品的安全性、效力和纯度产生影响，并且通常是外源性的。因此，应控制和证明其来源、质量、鉴定以及从最终产品中去除。生产商的质检报告（COA）、质量标准和申请人的COA必须是材料管理的最重要信息之一。最终产品中存在的辅料也应同样列出，应详细说明生产程序，并提供细胞产品的分离、传代、纯化、规模化扩增、收集，产品的制备和分装和最终产品检测的流程图，此外，应详细说明细胞的制备、工艺时间和中间品储存以及最终配方。
MSCs产品的质量研究应在整个开发和规模化生产过程，从代表性产品批次和适当生产阶段样品中选择的样品上进行。质量研究应涵盖各种细胞分析，包括功能、纯度和安全性，可根据产品特性和属性添加其他相关研究项目。生产商必须为MSCs产品制定质量标准和质量控制策略，MSCs产品应符合NMPA批准的药品质量标准，即药品注册标准。药品注册标准应当符合现行《中国药典》的一般技术要求，不得低于现行《中国药典》的规定。如果申报的注册品种所涉及的检测项目和指标不适用于现行《中国药典》，生产商应提供充分合理的支持数据，建议采用中间样品质量检验和最终产品放行试验相结合的机制。
MSCs产品的分析程序和方法必须经过系统地验证和确认，申请人应提交分析程序和方法验证和确认的数据，以支持MSCs细胞库和MSCs产品的鉴别、活力、质量、纯度和效力的文件。为了达到预期目的，分析程序和方法的典型验证特性应考虑下列因素：准确度、精度（包括重复性和中间精密度）、特异性、耐用性、检出限、定量限、线性和范围。分析报告，应包括原理、设备、操作参数、试剂、参考标准和材料、验收标准、样品制备、稳定性、标准制备、试验程序、系统适用性、计算、数据分析和结论。如果在MSCs产品的生命周期内，原材料、生产工艺、法定分析程序、国家标准和自行开发的分析程序发生任何关键变化，强烈建议开展再验证。此外，当生产商提议用替代分析程序替代经验证的分析程序时，或当分析程序从一个实验室转移到另一个实验室时，要求采用具有可比性的分析方法。目前，分析方法验证的主要挑战是中国乃至世界范围内标准品和参考品的严重短缺，因此，为了解决标准品和参考品严重短缺的问题，MSCs产品生产商与标准品和参考品开发机构之间的密切合作是非常必要和紧迫的。
随着研究的进展应逐步积累与过程相关的信息，并改进分析程序，以满足每个阶段的质量控制要求。质量控制一般应考虑鉴别试验（细胞形态、表型、细胞标记等）、生物功效、纯度、杂质、细胞数（活细胞数、功能细胞数等）、细胞生长活性、细胞周期、细胞倍增时间、克隆形成率和一般检测（如无菌检测、支原体、内毒素、端粒酶的表达和活性等）。应以细胞类型为基础进行细胞特性研究（包括细胞形态、细胞表面标志物、基因表达、细胞分化、表面标志物表达、效价测试、分泌组的定性和定量测量，以及过程中添加成分的残留量检测）。
应基于细胞的性质、特征和预期用途，建立MSCs产品功能研究的分析程序。为建立合理有效的生物功效分析程序，作用机制应与临床适应证一致，就细胞纯度而言，建议检测细胞亚群和活力。杂质研究应包括细胞加工（如蛋白酶、动物血清蛋白、重组蛋白和细胞因子等）以及最终细胞产物（如死细胞残留物和其他可能的生物降解产物等）。应根据细胞来源和工艺的特点考虑安全相关研究，并可针对外源病毒因子、细胞恶性转化的可能性、遗传稳定性、成瘤性和致瘤性等进行考虑。
有关细胞给药过程的模拟研究应该进一步开发和完善。如果在医院的研究中心进行 (细胞恢复、产品稀释等)，申请人应建立标准操作程序，并对临床研究人员进行良好的培训。强烈建议在完成给药操作前完成标准化工艺验证试验以验证最终产品质量（如细胞形态、细胞表型、多系分化效力、细胞数量和存活率、外观、效力、特性、无菌性、支原体、内毒素，其他外源性物质等）。效力评估，用于证明临床研究的所有阶段和市场批准后使用符合预定的规范或接受标准的产品批次。一般来说，对于细胞和基因治疗产品，没有单一的检测方法可以充分评估预测临床疗效的产品属性，因此，开发多个属性检测来评估细胞和基因治疗产品的效力是必要和可取的。
每一批产品都应该进行放行检验，最终产品的质量标准应在IND中明确设置，通常采用表格格式，最终放行检验数据最好是在MSCs产品临床使用之前提供。所有产品从细胞收集到临床给药必须是可追踪和可识别，并贴上适当标签。
MSCs产品的稳定性研究
推荐MSCs产品的生产采用连续工艺。对于生产过程中需要临时储存的样品，应进行储存稳定性研究，以支持其储存条件和储存期限。为了证明最终细胞产品在研究所需时间（从最终放行到给药）足够稳定稳定性试验必须要进行，并应注明最终产品的有效期。MSCs产品稳定性研究的基本原则，可以根据产品自身特点、临床用药需求以及存储、包装和运输的运输条件，制定合理的研究计划。研究应使用具有代表性的细胞样本和存储条件进行。此外，还应开发和优化最终产品运输方案，并对方案稳定性进行验证。此外，还应验证给药前的产品准备程序以确认最终产品质量合格。
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