脐带间充质干细胞治疗激素耐药重度急性移植物抗宿主病

撰文│廖联明

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

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急性移植物抗宿主病（aGVHD）是异基因造血干细胞移植（allo-HSCT） 的严重并发症，也是导致患者死亡的重要因素。大剂量皮质类固醇是aGVHD的 一线疗法， 约50%的aGVHD患者表现出激素耐药。对激素耐药的aGVHD目前还无有效的二线疗法。基于间充质干细胞（MSC）体内外免疫调节特性，研究者尝试将其应用于aGVHD的治疗，并取得了一定疗效。这些研究中采用的MSC包括来自脐带的MSC。虽然这些数据支持脐带MSC的有效性，但大多数数据来自非随机对照临床试验和病例系列研究。研究结果间差异明显，可能与各研究中脐带MSC的制备方法有关。将来有必要在全球范围内制定标准的脐带MSC制备方法和检验标准，促进脐带MSC的产业化和临床应用。

一、前言

异基因造血干细胞移植（allogeneic hematopoietic stem cell transplantation，allo-HSCT）是化疗、靶向治疗等无法治愈的恶性及非恶性血液病的有效方法。预处理方案、高分辨率人类白细胞抗原（HLA）分型、移植物抗宿主病（graft versus host disease，GVHD）预防方案及支持治疗的发展使移植后患者的生存率和生存质量越来越高。GVHD是allo-HSCT后最常见和最严重的并发症，甚至影响患者的生存率。GVHD是一种全身炎性疾病，其病理学机制是供体来源的淋巴细胞将受体抗原识别为外来抗原，诱发免疫反应。活化的T细胞试图消除宿主细胞，从而导致严重多器官损伤。

在allo-HSCT过程中预防GVHD发挥着关键作用。常用预防药物包括环孢霉素A、他克莫司、针对T淋巴细胞的单克隆抗体、mTOR抑制剂和甲氨蝶呤。尽管GVHD的预防和治疗取得了部分进展，但这种危及生命并发症的发生率仍然很高。约50%的受者发生aGVHD。aGVHD通常累及皮肤、肠道及肝脏，表现为丘疹、恶心、呕吐、腹泻和肝内胆汁淤积。aGVHD根据严重程度可分为4级，14%的患者发生Ⅲ-Ⅳ级严重aGVHD。aGVHDⅠ-Ⅱ级患者的5年无白血病生存率为44%~51% ；相比之下，Ⅲ级患者生存率降至26%， Ⅳ级患者生存率降至7%。大剂量皮质类固醇是aGVHD的一线治疗方法，40%~60%的患者在用药后几天内即可见效。但其他患者在接受皮质类固醇治疗3~7天后病情没有好转，表现出激素耐药。发生激素耐药的aGVHD患者长期预后很差，1年总生存率低于30%，死亡可能是由aGVHD直接引起，也可能是免疫抑制后遗症，如潜伏病毒的再激活、败血症或肿瘤复发。目前为止还没有标准的方法作为二线治疗。二线治疗药物包括抗胸腺细胞球蛋白（ATG）、环孢霉素、霉酚酸酯、抗IL-2受体、抗CD5特异性免疫毒素、泛T细胞蓖麻毒素A链免疫毒素、ABX-CBL（CD147 单抗）、依那西普、英夫利昔单抗、达利珠单抗和维利珠单抗等。这些药可单独使用，也可联合使用。药物的选择主要依靠经验，但没有足够数据对这些药物进行比较。慢性GVHD（cGVHD）通常发生在移植后100天内，导致受累器官炎症和纤维化，表现为干燥综合征、硬皮病样皮肤变化、慢性肺纤维化、肝脏和肠道损伤。与GVHD发生及严重程度相关的主要危险因素是供、受者之间HLA不匹配。

在造血系统的恶性肿瘤中，供体淋巴细胞发起的移植物抗白血病（graft-versus leukemia，GVL）反应和GVHD共存。如何在减弱GVHD的情况下增强GVL效应一直是allo-HSCT治疗恶性血液病的挑战。基于MSC的体外免疫调节特性，研究者尝试将其应用于aGVHD治疗。2004年，Le Blanc等人采用骨髓MSC输注治愈了1名9岁男孩的难治性肠道和肝脏Ⅳ级aGVHD，为MSC的临床应用打下了基础。此后脂肪、胎盘、脐带和牙髓等组织中的MSC被发现，不同来源的MSC陆续被尝试代替骨髓MSC应用于临床。

二、脐带MSC特征

脐带MSC与经典的骨髓MSC有很多共性。脐带MSC表达一些原始干细胞的标志，如ESC样抗原Tra-1-60、Tra-1-81、TERT、SSEA-1 和SSEA-4 多表达与干细胞潜能相关基因，如Oct-4、NANOG、Rex1和SOX-2。与骨髓MSC相比，脐带MSC表达更高水平的NANOG、DNMT3B 和GABRB3，反映了脐带MSC更原始特性，此外脐带MSC表达原始干细胞标记物TERT。这些可部分解释脐带MSC具有较短倍增时间及更强扩增能力。

三、脐带MSC的免疫调节机制

脐带MSC治疗GVHD的作用与其再生和免疫调节潜能密切相关。脐带MSC具有免疫调节和免疫逃逸能力，适合作为异基因细胞用于移植。此外脐带MSC表达极低Ⅰ类HLA，不表达HLA-DR，这表明脐带MSC具有极低免疫原性，脐带MSC不会刺激异基因T细胞产生体外免疫应答，此理论上异体MSC输注后不会被清除。此外脐带MSC诱导调节性T细胞（Treg） 扩增， 这将有助于抑制同种异体抗原反应。脐带MSC产生白细胞介素（IL）-10、转化生长因子-β（TGF-β）、肝细胞生长因子（HGF）、前列腺素E2（PGE2）及吲哚胺2,3-双加氧酶（IDO），介导脐带MSC对T细胞的免疫调节。当与CD14⁺单核细胞共培养时，脐带MSC通过直接接触及分泌可溶性因子抑制其向成熟DC分化。脐带MSC在体外能够抑制B细胞增殖、分化和分泌抗体。

四、临床前研究

髓源性抑制细胞（MDSC）是来源于骨髓的早期髓系祖细胞的异质性群体，可抑制炎症反应。天津医科大学一中心临床学院体外实验证实脐带MSC分泌HLA-G蛋白，促进外周血MDSC增殖，增强MDSC抑制T细胞增殖并促进Treg细胞增殖功能。研究人员发现过表达HLA-G的脐带MSC诱导受体小鼠产生的MDSC更强，提高MDSC抑制T细胞能力。研究人员将主要组织相容性复合体（MHC）不相容的C57BL/6（H-2^b）小鼠骨髓（BM）细胞和脾细胞（SC）移植至经8Gy钴-60致死性照射后的BALB/c小鼠体内，建立aGVHD小鼠模型，观察移植后14天和28天小鼠总存活率、aGVHD严重程度及外周血MDSC变化。在GVL模型中，小鼠移植A20细胞（小鼠B细胞性淋巴瘤）（3×10⁵/只）。发现照射后接受BM移植的小鼠在60天内存活。而BM+T细胞组小鼠在21天左右出现严重的aGVHD，如脱发、弓背、腹泻及死亡，60天死亡率接近100%。移植脐带MSC（BM+T+MSC组）的小鼠症状较BM+T组明显改善，皮肤、小肠、肝脏的病理学改变也较轻，近40%小鼠存活60天以上。重要的是该研究发现MSC不影响GVL效应。

上海第六人民医院课题组进行的脐带MSC治疗aGVHD动物研究中，受体小鼠为DBA-2（H-2K^d）品系；供体小鼠为C57BL/6（H-2K^b）品系，提供BM 细胞和SC。对BA-2（H-2K^d）小鼠（受体）进行全身致死性照射后通过尾静脉注射来自C57BL-6（H-2K^b）小鼠（供体）的3×10⁷个BM细胞和1×10⁷个SC。实验组24小时内移植MSC，比较两组小鼠的生存率、体重、病理组织学变化及aGVHD 评分。移植30天后MSC组有60%小鼠存活，对照组18天内全部死亡。MSC可减轻异基因骨髓移植后aGVHD症状，包括脱发、驼背、脸肿、腹泻和体重减轻。移植后第7天，aGVHD小鼠在肝脏镜检中表现出典型aGVHD变化，包括门区周围存在明显淋巴细胞浸润、局部坏死及静脉淤滞。在肠道中也观察到aGVHD的特征性变化，包括与细胞凋亡相关的隐窝萎缩及严重的炎症细胞浸润。相比之下，7天后MSC组的小鼠肝脏和肠道标本中很少出现炎症细胞浸润。此外，在移植后第21天，原来少量的炎症细胞浸润已经消失。

另外一个研究中， 解放军总医院第五医学中心课题组发现当采用PHA激活T细胞时，脐带MSC对T细胞增殖的抑制率达44.82%，可抑制IFN-γ分泌。研究人员在雄性C57BL/6小鼠和雌性BALB/c小鼠之间进行MHC不匹配小鼠移植。将雄性C57BL/6小鼠供体SP细胞和BM细胞输注到接受亚致死照射的雌性BALB/c小鼠体内。实验组在第一天同时静脉注射人脐带MSC。所有对照组小鼠均出现严重GVHD症状，表现为驼背姿势、毛发暗淡、体重减轻及严重腹泻，并在40天内死亡。脐带MSC输注显著降低aGVHD所有临床症状，提高移植小鼠40天存活率到40%。与治疗组相比，对照组肠道、皮肤、肝脏的aGVHD组织学损伤度更严重。

五、临床研究

Wu Kang Hsi等人在2011年第一次报道了脐带MSC在两名严重激素耐药的aGVHD儿童患者中的应用。第1位患者是一个4岁男孩，因严重再生障碍性贫血进行HLA匹配的allo-HSCT。移植第45天患者出现aGVHD，类固醇治疗无效。输注4/6 HLA匹配的脐带MSC（3.3×10⁶细胞/kg） 后第2天腹泻程度减轻，第6天总胆红素浓度降至正常范围，第7天皮疹消退。此后患者继续接受2次脐带MSC输注。移植后12个月所有免疫抑制药物停止使用，未发生cGVHD。第2位患者是一个6岁急性淋巴细胞白血病男孩，移植2个单位的4/6 HLA相匹配的脐带血。第21天患者出现高胆红素血症和黄斑丘疹。他接受了3/6 HLA匹配的脐带MSC（4.1×10⁶细胞/kg） 治疗。5天后aGVHD临床表现消失，移植后10个月停用所有免疫抑制药，未观察到cGVHD。

2012年新桥医院报道了脐带MSC在aGVHD的疗效及安全性。40例激素耐药aGVHD患者分为2组，脐带MSC组接受他克莫司+甲氨蝶呤（MTX）+脐带MSC治疗；常规治疗组仅接受他克莫司+MTX治疗。结果脐带MSC组治愈率、有效率均高于常规治疗组。同年苏州大学附属第一医院报道了脐带MSC输注治疗9例激素耐药的aGVHD安全性及疗效。19例患者平均MSC输注总剂量为2.13（0.60～7.20）×10⁶/kg。11例获得完全缓解，4例获得部分缓解，4例无效。2014年厦门大学附属中山医院血液科报道了10例allo-HSCT后发生cGVHD患者，常规免疫抑制治疗无效后给予脐带MSC治疗，治疗剂量2×10⁷个细胞，治疗总有效率70%。原北京军区总医院研究了37例接受allo-HSCT和随后输注脐带MSC的小儿重型再生障碍性贫血（SAA）患者结局。脐带MSC剂量为1.0×10⁶/kg。aGVHD发生率为45.9%（17/37），cGVHD发生率为18.9%（7/37），GVHD相关死亡率为18.9%（7/37），证明了移植后脐带MSC输注的安全性。2015年苏州大学附属儿童医院报道10例血液病患儿allo-SCT后出现aGVHD，在激素加免疫抑制剂治疗效果不佳的基础上予脐带MSC输注治疗，10例患儿aGVHD症状均缓解。同年同济医科大学协和医院报道了应用脐带MSC治疗allo-HSCT后难治性GVHD患者24例。结果表明脐带MSC输注后GVHD症状明显减轻，原发疾病复发率、移植相关并发症无明显增加。2018年原海军总医院儿科报道了脐带MSC治疗5例儿童allo-HSCT后难治性aGVHD的疗效及安全性。输注细胞数量为（1.5～2.0）×10⁶/kg。结果5例难治性aGVHD患儿均出现好转，总体反应率为100%。2020年苏州大学附属儿童医院回顾性分析了2014年2月至2018年12月行allo-HSCT术后发生激素耐药的aGVHD患儿临床资料59例，根据治疗过程中是否接受脐带MSC治疗分为脐带MSC组（n=33）和常规组（n =26）。脐带MSC组中MSC静脉输注平均细胞数为1.70（0.43~5.78）×10⁶/kg。与常规组相比，脐带MSC组在治疗aGVHD改善的中位时间上更短（12d vs 18d，P＜0.05）。

国外脐带MSC治疗aGVHD临床研究较少。2016年，Boruczkowski等人报道了脐带MSC用于治疗10例激素耐药GVHD患者，平均剂量为1.5×10⁶个细胞/kg，6例有效，其中2例GVHD完全缓解，4例症状减轻，免疫抑制剂量减少。2020年发表的一项1期临床研究中，对10例新发高危或激素耐药的aGVHD患者进行了脐带MSC（代号MSCTC-0010）治疗。脐带MSC在第0天和第7天静脉注射（低剂量组：2×10⁶/kg，n=5 ；高剂量组：10×10⁶/kg，n =5）。在第28天总有效率为70%，10例患者中4例完全反应（CR），3例部分反应（PR）。

六、胞外囊泡

不同细胞分泌的细胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）有不同生物学特性。在过去10年，有证据表明EV具有部分来源细胞的生物活性。EV可从体液或细胞培养上清液中获取。EV包括直径为50～150 nm 的小EV（也称为外泌体）和较大的微泡（可达1000nm）。这种非细胞的细胞疗法有助于规避含有活细胞生物疗法的复杂工艺和质量控制问题，同时避免细胞治疗潜在副作用。体外和体内实验证据表明脐带MSC来源的EV具有脐带MSC相似的免疫调节作用。

脐带MSC分泌的EV富含程序性死亡配体1（PD-L1）。在aGVHD患者中观察脐带MSC输注后外周血PD-L1快速增加。此外，体外实验中加入抗体中和PD-L1后EV即不再抑制T细胞，说明EV来源的PD-L1发挥了抑制作用。

脐带MSC释放的EV（MSC-EV）可预防allo-HSCT小鼠模型的aGVHD。受体BALB/c小鼠接受X射线全身照射4～6h后输注6×10⁶供体C57BL/6小鼠BM细胞和3×10⁶ SP细胞重建造血系统并诱导aGVHD。移植BM细胞和SP 细胞第0天和第7天注射200μg脐带MSC-EV。结果显示，脐带MSC-EV可减轻aGVHD表现及相关组织学改变，显著降低受体小鼠死亡率。接受脐带MSC-EV治疗小鼠的CD3⁺CD8⁺T细胞百分比和绝对数显著降低，血清IL-2、TNF-α和IFN-γ水平降低，血清IL-10水平升高。体外实验表明脐带MSC-EV对有丝分裂原诱导的脾细胞增殖有剂量依赖性抑制作用，且抑制细胞因子分泌。为探讨脐带MSC是否可通过EV相关PD-L1起效，研究人员在其中心的一项临床试验中检测了输注脐带MSC的aGVHD患者血浆样本中EV和PD-L1水平。MSC输注后1小时，所有EV亚群，包括CD63⁺CD81⁺、CD63⁺CD9⁺和CD9⁺CD81⁺ 均有显著增加。与给药前血浆水平相比，脐带MSC输注后30分钟血浆PD-L1水平升高50%。输注后1～8小时血浆PD-L1水平随时间下降，但与基线水平相比仍然较高。此外作者观察到多次输注和高细胞剂量的患者血浆PD-L1水平也更高。因此体内的研究结果表明，在aGVHD患者中EV-PD-L1 能是脐带MSC发挥免疫抑制的成分。

七、展望

MSC是治疗aGVHD的选择之一。大多数病例系列报告了良好结果。多数研究中应用的是人骨髓来源的MSC。不同试验中MSC输注数量及MSC剂量变化很大。Trento等人通过问卷调查分析了17个欧洲血液和骨髓移植中心的数据。88%中心生产骨髓来源的MSC，只有2个中心生产脐带MSC。各研究间结果差异明显，可能与每个研究中脐带MSC的制备方法不同有关。将来有必要在全球范围内制定标准的制备方法和检验标准，促进脐带MSC业化和临床应用。

作者简介

廖联明  研究员

   现任福建医科大学协和医院中心实验室研究员。主要从事间充质干细胞临床应用和造血干细胞分化研究，为中华医学会医学工程学分会干细胞工程专业委员会委员，《中华细胞与干细胞杂志》《中国临床药理学杂志》和Vascular Investigation and Therapy杂志编委。在Diabetes、JAMA、J Clin Oncol 、Cytotherapy等杂志发表多篇干细胞的临床应用研究论文。《医学参考报》干细胞与再生医学专刊   由同济大学附属东方医院承办感谢大家的支持！

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