人源化小鼠模型在间充质干细胞免疫调节功能研究中的应用

撰文│廖联明

编辑│毕紫娟

审校│汤红明

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间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC） 广泛分布于人体中，也可以由胚胎干细胞（ESC）及诱导多能干细胞（iPSC） 诱导分化而来。MSC有很强的免疫调节及抗炎特性，可抑制效应T细胞增殖，诱导巨噬细胞转化为M2抗炎型，调节树突状细胞（DC），诱导调节T细胞（Treg），影响B细胞增殖及成熟并抑制自然杀伤T细胞增殖。MSC主要通过细胞与细胞间接触和分泌可溶因子发挥作用。可溶性因子包括吲哚胺2，3-加双氧酶、肝细胞生长因子、转化生长因子β，前列腺素E2、IL-10、IL-6和单核细胞趋化蛋白-1等。

虽然MSC介导的免疫抑制机制还未完全清楚，许多MSC治疗免疫性疾病的临床试验已经开始，包括移植物抗宿主病（GVHD）、再生障碍性贫血、多发性硬化、风湿性关节炎和克罗恩病。在加拿大和新西兰MSC获得有条件上市批准，用于治疗类固醇抵抗和（或）免疫抑制剂抵抗的小儿急性GVHD（aGVHD）。Cynata  Therapeutics公司源于iPSC的MSC也开始了临床试验，用于治疗GVHD。尽管MSC已应用于临床，仍需要研究更好的MSC效能（potency）评价方法并对接受治疗的患者进行更全面的免疫监控。为此需要更好的模型来研究MSC的免疫抑制功能的机制，而人源化小鼠就是最好的选择。

一、人源化小鼠作为研究MSC免疫调节作用的模型

虽然体外研究可证明MSC免疫调节的特性，但体外环境无法完全反映人体免疫反应的复杂性。小鼠模型也不能完全模拟人类免疫系统，因为人类和小鼠在MHC的表达、细胞因子和共刺激分子都有不同, 因此必须采用人源化小鼠来研究MSC的免疫安全性和免疫学机制。

人源化小鼠是指带有人部分组织的模型小鼠。植入人类免疫细胞或免疫系统的免疫功能低下小鼠是最常用的人源化小鼠。为了构建人源化小鼠，先让小鼠接受亚致死性全身辐照，然后注射人造血干细胞（hematopoietic stem cell, HSC），在小鼠体内重构人免疫系统。人源免疫细胞会对小鼠免疫系统产生免疫耐受，通常不会发生GVHD。最早的免疫缺陷小鼠T和B淋巴细胞介导的免疫功能都缺失的SCID小鼠。此后建立的模型小鼠包括敲除各种基因的免疫缺陷小鼠，如NOD/SCID/IL2rγ^null（NSG）小鼠、NODShi.Cg-Prkdc^scidIL2rγ^tm1Sug小鼠、BALB/c-Rag2^nullIL2rγ^null小鼠、C57BL/6-Rag2^nullIL2rγ^null小鼠和 NOD-Rag1^nullIL2rγ^null小鼠。在这些小鼠中移植人类免疫细胞，如外周血单个核细胞（PBMC） 或CD34⁺HSC后获得含人类T细胞的人源化小鼠。然而这些小鼠的胸腺不能完成对人类T细胞的教育和筛选。人骨髓、胎肝和胎胸腺化（BLT）小鼠能根据人类MHC进行T细胞筛选。BLT小鼠的产生需要将人类胎儿胸腺和肝脏小块植入小鼠肾被膜下，然后移植来自同个胎儿肝脏的CD34⁺细胞。NeoThy人源化小鼠是将人类新生儿胸腺和人CD34⁺细胞植入免疫缺陷小鼠建立的。在人类MHC分子中进行T细胞关联的另一办法是使用基因改造的人源化小鼠，这些小鼠能表达人白细胞抗原（HLA）分子。

二、人源化小鼠用于MSC的免疫安全性评价

目前评估MSC免疫原性和安全性的方法是采用正常大鼠或灵长类动物。虽然一般认为MSC是免疫赦免的细胞群，但有报道表明异体MSC有免疫原性。在这种情况下，人源化小鼠是用于评估MSC免疫原性和安全性的有效工具。

Lee 等人用人类CD34⁺细胞重构的NSG小鼠模型（NSGCD34⁺）研究异体人类MSC的免疫安全性。研究人员证明源于脐带血（UCB）的MSC在体外不表达MHCⅡ分子。在体外与PBMC共培养后，UCB-MSC表达HLA-G，诱发免疫耐受。在NSGCD34⁺小鼠注射UCB-MSC后T细胞增殖能力下降，IFN‐γ、TNF‐α、IgG的分泌也减少，意味着异体UCB-MSC的免疫原性确实很低。

在无IFN-γ刺激下，iPSC-MSC、胎儿MSC（fMSC）和成人骨髓MSC（BM-MSC）都不表达MHCⅡ。在IFN-γ刺激下iPSC-MSC表达极低水平的MHCⅡ分子，而fMSC和BM-MSC表达水平更高，意味着iPSC-MSC有更低的免疫原性。研究人员进一步在后肢缺血的人源化NSG-PBMC模型比较iPSC-MSC和BM-MSC的疗效、生存率和对炎症的作用。通过对缺血后肢肌肉组织中CD45⁺和CD4⁺细胞定量确定缺血后肢的炎症水平。用绿色荧光蛋白（GFP）标记MSC。结果显示，人类iPSC-MSC细胞较少造成炎症并且与BM-MSC相比能更好地改善后肢缺血，细胞存活率更高。

这些研究展示了人源化小鼠作为体内模型用于评估的MSC免疫安全性是比较理想的。

三、人源化小鼠用于评价MSC治疗GVHD的效果

在国外MSC可在某些条件下获得上市，用于治疗aGVHD，这是因为临床试验数据还不能得到确切结论，且MSC的免疫调节机制也不清楚。Tobin等人将NSG-PBMC人源化小鼠作为GVHD的模型， 注射人类MSC。MSC治疗后肝脏和肠道症状减轻，且明显提高了小鼠生存率。然而MSC不能阻止慢性GVHD的发生，这与临床试验结果一致。MSC能够抑制供者T细胞增殖，降低TNF-α产生。另一个研究在NOD/SCID小鼠（ 用人类PBMC重构免疫系统）上用UCB-MSC治疗GVHD。UCB-MSC可预防GVHD发生，但不能治疗GVHD，这些发现与临床试验数据高度一致，因此NSG-PBMC GVHD小鼠是探索MSC免疫抑制机制的理想模型。

四、人源化小鼠用于评价MSC治疗移植排斥的机制

Roemeling-van Rhijn等人在移植人类皮肤的人源化SCID-PBMC小鼠身上比较BM-MSC和来源于脂肪组织的MSC的免疫调节作用。皮肤移植显示了明显的CD45⁺T细胞浸润，由CD4⁺和CD8⁺T细胞组成，并且IFN-γ表达增加，提示有移植排斥反应。对照组小鼠移植人类皮肤但不输注人类PBMC。对照组小鼠未发现白细胞浸润，人皮肤被识别为同种异体组织而不是异种组织。BM-MSC和来源脂肪的MSC对皮肤移植的同种异体反应有明显抑制作用，并且疗效相似。重要的是，此研究证明人源化SCID-PBMC是评价MSC治疗异体移植排斥的理想模型。

在糖尿病NSG-PBMC模型Wu等人证实在人源化小鼠模型中将胰岛和BM-MSC共同移植能提高胰岛的存活率并明显延长非胰岛素依赖的时间。作者证实BM-MSC介导的单核细胞的活化并产生IL-10和通过可溶因子促进Treg细胞增殖是BM-MSC促进同种异体移植的重要机制。

五、人源化小鼠用于评价MSC治疗免疫介导疾病的机制

MSC目前在GVHD、重症肌无力（MG）、系统性红斑狼疮、克罗恩病等免疫相关疾病有不少应用报道。MG是罕见的自身免疫神经肌肉疾病，其特征是存在抗乙酰胆碱受体（AChR）抗体。为了在小鼠模型中模拟MG，Sudres等人将MG患者胸腺小片移植到NSG小鼠，NSG-MG小鼠出现类似MG的症状，并且检测出鼠抗人AChR抗体。研究人员比较了来自人体脂肪组织的休眠状态的MSC（rMSC）与在体外预处理的MSC（cMSC）的治疗效果。预处理方法是体外MSC和异体PBMC 共同培育3天。该研究表明，cMSC降低治疗小鼠的MG发生率和严重程度比rMSC更显著。

Ni等人利用人类PBMC重建小鼠免疫系统，然后注射博来霉素，制作肺纤维化人源化小鼠模型。注射人类BM-MSC可减轻人源化小鼠肺纤维化。进一步研究发现MSC能够调节博来霉素引起的异常T细胞活化，而且MSC表达的PL1在抑制肺浸润T细胞方面起重要作用。

六、总结

尽管MSC已用于临床，但MSC免疫调节作用的潜在机制还未完全了解。临床试验结果存在争议，如在治疗GVHD的时候，探索MSC的免疫调节机制尤其重要。人源化小鼠模型的快速发展为探索细胞疗法的机制提供了很好的方法。

作者简介

廖联明  研究员

现任福建医科大学协和医院中心实验室研究员。主要从事间充质干细胞临床应用和造血干细胞分化研究，为中华医学会医学工程学分会干细胞工程专业委员会委员，《中华细胞与干细胞杂志》《中国临床药理学杂志》和Vascular Investigation and Therapy杂志编委。在Diabetes、JAMA、J Clin Oncol 、Cytotherapy等杂志发表多篇干细胞的临床应用研究论文。

《医学参考报》干细胞与再生医学专刊

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