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程强点评 | Science长文报道：下一代mRNA疫苗开发关键——LNP
脂质纳米颗粒（LNP）是mRNA药物常用的载体。目前，BioNTech/辉瑞和 Moderna的mRNA疫苗都采用LNP作为运输载体，这是这些疫苗成功的关键要素之一。
LNP是一种多组分系统，通常由可电离脂质或阳离子类脂质化合物、辅助脂质、胆固醇、保护剂聚乙二醇-脂质共轭物组成。
LNP可将mRNA包裹在结构内部空腔中，这种结构可以提高mRNA体内稳定性，有利于mRNA发挥作用。然而，制剂中的LNP载体是药物注射后疼痛与炎症等不良反应的主要诱因。此外，mRNA发挥作用必须经过其翻译出对应的蛋白质实现，需要mRNA从颗粒中逃逸出来，然而，这对于细胞内的LNP颗粒非常困难。最后，当温度升高时，mRNA具有从LNP中解离的倾向，因此这种制剂必须低温保存，这也限制了这种剂型在全球范围内的使用。总结来说，尽管这种递送技术的作用有目共睹，但还有很大的优化空间。
温哥华不列颠哥伦比亚大学（UBC）的生物化学家Pieter Cullis开创了LNP药物递送系统，他表示：“这种系统明显很有前景，但是我们还需要提高LNP的性能，这是肯定的。” 2020年，Cullis创立了NanoVation Therapeutics，开发了利用LNP将核酸安全有效地输送到各种组织的下一代平台技术。
来源：NanoVation Therapeutics官网
目前，大型制药巨头和生物技术公司正在开发新一代LNP系统。新一代LNP技术递送能力更强、副作用更少，可以帮助mRNA获得更高的稳定性并提高mRNA药物的组织靶向能力。改进后的这种纳米颗粒可以帮助新冠和其他疾病的mRNA疫苗实现更佳的疾病预防效果，同时也可以助力mRNA药物发挥治疗疾病的潜能。Philip Santangelo是佐治亚理工学院的生物医学工程师，目前与多家mRNA公司合作过。他表示：“递送方式的创新一定可以改变游戏规则。”
Cullis在大概20年前开发了首个LNP系统，将基因沉默药物递送至细胞内。后来，他和同事设计了LNP系统中的4种脂质成分，帮助mRNA进入细胞治疗疾病。这种技术目前在疫苗中进一步扩大使用。RNA疫苗公司VaxEquity的联合创始人，同时也是UBC生物工程师Anna Blakney表示：“这里面仍需要进行大量的优化开发工作。”当谈到如何理解细胞与纳米颗粒相互作用时，她补充道：“这还是一个很大的问号。”
VaxEquity 是一家英国生物技术公司，开发下一代自扩增 RNA 和 mRNA疫苗（来源：VaxEquity官网）
3月24日，来自基因泰克的科学家研究了纳米颗粒如何激活一条特定的炎症通路，为这一问题找到了部分线索。白介素1（interleukin-1，IL-1）对提高身体免疫力至关重要，但是这种炎症因子也可能诱发某些副作用。SM-102是一种可电离脂质，与mRNA结合并将mRNA封装于LNP内部。实验中，SM-102显著激活了这种通路。Moderna的mRNA疫苗也是基于SM-102制备的，这可能是这种疫苗在发挥较强的防护作用的同时导致部分接种者感到恶心的原因。
人体免疫细胞中，RNA疫苗诱导产生IL-1细胞因子（取决于RNA和脂质制剂，但主要是IL-1β）。IL-1将触发包括IL-6在内的广谱促炎因子释放（来源：Nature Immunology）
基因泰克研究团队没有评估BioNTech /辉瑞mRNA疫苗中使用的类似的脂质。而来自宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的Mohamad-Gabriel Alameh测试了一种相关的脂质分子。这种脂质分子触发了一系列炎症分子，这其中既有促进疗效的，也有导致不良反应的。目前，研究人员期望可以设计出激活有利的免疫反应，而不会过度刺激有害免疫通路的可电离脂质。Alameh表示：“这并不简单，但应该是可能的。”
AexeRNA Therapeutics利用专有的LNP递送平台技术AexLNP开发新型mRNA疗法和疫苗（来源：AexeRNA官网）
Michael Buschmann与Alameh等人共同创立了AeceRNA Therapeutics。Buschmann曾于2021年带领一个研究团队，证明了LNP的电荷对疫苗非常重要。小鼠实验中，负电荷不利于LNP停留在肌肉和淋巴结中引发预期的免疫反应；相反，负电荷的LNP倾向于在体内广泛分布，提高小鼠发烧、寒颤和其他不良反应的风险。
LNP递送效率的主要影响因素之一是可电离脂质的pKa。负电性LNP肌内给药后会在肝脏中出现更多的脱靶蓄积，这可以通过离子型脂质和LNP的适当优化改善（来源：Communications Biology）
为了减少LNP的电荷负载量，研究人员替换了具有不同化学性质的可电离脂质。根据去年在预印本平台上发表的论文，这种新型LNP制备的新冠mRNA疫苗在小鼠体内产生了相较于传统递送系统更多的保护性抗体，而且副作用更少。
一种多质子可电离脂质C24肌内给药可减少肝脏蓄积，提高编码蛋白表达水平，增强病毒防御能力（来源：Research Square）
特拉维夫大学的生物化学家、疫苗递送领域初创公司NeoVac的联合创始人Dan Peer还开发了具有非典型结构的新型可电离脂质库。在一项未公开发表的实验中，这些新型可电离脂质可以帮助mRNA疫苗产生较少的副作用，并且在室温条件下的稳定性更强。
目前，也有研究团队致力于改善LNP的细胞摄取与内涵体逃逸。内涵体帮助LNP进入细胞，然而，大量的LNP被束缚在内涵体内，导致mRNA还没有被释放就被内涵体破坏了。俄勒冈健康与科学大学的生物工程师Gaurav Sahay评论道：“有大量的RNA没有发挥作用。”
和胆固醇一样，可电离脂质的形状也可以影响LNP从内涵体中逃逸的能力。Sahay及其同事于2020年报道了不同类型的胆固醇可以改善LNP从溶酶体逃逸的速率。Sahay成立了一家名为Enterx Biosciences的公司，致力于将这些发现商业化。
将C-24 烷基植物甾醇引入LNP（eLNP）可提高基因转染能力。烷基链的长度、甾醇环的柔性与羟基极性是转染能力的重要影响因素。相对于传统的LNP的球形结构，eLNP结构呈多面体。eLNP细胞摄取和保留增强，从内涵体中稳定释放的能力更大。（来源：Nature Communications）
赛诺菲已经开始对特制的LNP进行头对头的临床试验。例如，在一项2021年启动的一项试验中，该公司评估了两种递送流感mRNA疫苗的LNP制剂。根据初步数据，赛诺菲mRNA卓越中心研究和生物标志物负责人Frank DeRosa在2021年12月的一次投资者活动中宣布，其中一种脂质纳米粒预防流感性能显著，但在高剂量下也导致了更多的不良反应。
Arcturus Therapeutics是一家专注于RNA疗法的公司，目前产品管线中有2个新冠疫苗分别进入临床III期与II期，一项肝脏mRNA药物进入临床II期（来源：Arcturus官网）
而包括BioNTech和Arcturus Therapeutics在内的其他公司已经开始试图从LNP中除去PEG。PEG在LNP可以起到稳定结构的作用，但近来有研究表明PEG与疫苗某些不良反应有关。与此同时，其他更多的公司则致力于优化递送mRNA的脂质，拓宽mRNA应用场景，实现从预防到治疗的跨越。输注LNP后，这种纳米颗粒往往倾向于分布到肝脏中。为了实现治疗疾病，需要提高mRNA编码纠正疾病的蛋白质精准递送到目标细胞或组织中的能力。
NanoVation Therapeutics的联合创始人兼首席执行官Dominik Witzigmann表示：“LNP的递送将成为扩展mRNA应用领域的关键。”
聚肌氨酸（pSar）是内源性物质肌氨酸的聚合物。利用pSar代替PEG实现减少LNP的聚集和体内的网状内皮系统清除作用，可提高RNA转染效率，减少促炎因子释放，降低补体活化（来源：ACS Applied NanoMaterials）
随着mRNA新冠疫苗为BioNTech/辉瑞和 Moderna带来的丰厚利润，产业界对于LNP技术的关注度日益提高，与之相关的利益冲突也越来越多。Alnylam Pharmaceuticals开发的第一款以LNP递送的一种基因沉默药物于2018年获批，用于治疗一种罕见的神经退行性疾病。Alnylam认为在其基础专利中覆盖了BioNTech/辉瑞和Moderna新冠疫苗中的脂质成分权利要求。而Cullis创立的另一家加拿大公司Arbutus BioPharma也在向Moderna索取赔偿，因为Arbutus声称Moderna侵犯了该公司一项由一定比例脂质构成LNP系统的专利。
不过，伊利诺伊大学法学院生物技术专利律师Jaco Sherkow认为，这些产权纠纷不会对LNP创新造成负面干扰，“这个领域有太多钱可以烧了。”
星锐医药 科学创始人 程强博士
程强博士，星锐医药科学创始人、北京大学研究员、国家级青年人才。长期从事新型 RNA 脂质纳米药物研发，以脂质纳米颗粒（LNP）为技术支撑，通过精准递送 RNA（mRNA、siRNA、Cas-sgRNA等）到病灶部位，以实现 RNA 在遗传性疾病、代谢类疾病、癌症等多种疾病中的治疗应用。以第一/通讯作者（含共同）在Nature Nanotechnology、Nature Materials、PNAS、Nature Communications、Advanced Materials 等期刊相继发表学术论文40余篇，被引2400余次，申请或已授权国际/国内专利10余项，多项研究成果已帮助中、美多家生物技术公司获得数亿美元融资。
2011年到2016年，我在北京大学分子医学研究所攻读博士学位，导师是梁子才教授。梁子才教授是（苏州）瑞博生物公司的创始人、董事长，也是国内小核酸（siRNA）制药的领军人物。大家现在已非常熟悉，当前siRNA的肝脏靶向递送是以GalNAc缀合为主，但在很多年前，LNPs则是递送siRNA的主流，并且第一款问世的Onpattro药物正是使用的MC3 LNPs载体。我在读博期间可以接触到非常多最前沿的siRNA药物研发项目，也是在那个时候开始研究LNPs载体。
SORT-LNP技术的优势
经过多年的探索，我与合作伙伴在LNPs技术开发方面也取得了一些创新成果。在2020年发表于Nature Nanotechnology 杂志上的一项研究中，我们首次报道了SORT（Selective ORrgan Targeting）技术。通过额外添加一种SORT分子，我们系统地设计了多种靶向肝外组织的LNPs。我们证实，在SORT分子的帮助下，LNPs可特异性靶向肺、脾、肝脏，并实现相关细胞（包括上皮细胞、内皮细胞、B细胞、T细胞和肝细胞）的mRNA递送和基因编辑。
与传统LNPs的研发相比，SORT技术最大的优势在于可预测性和简便性。由于SORT技术具有普适性，在研发靶向LNPs载体的时候可以明确给出研发方向，因此大大降低了LNPs筛选库的样本量，从而缩短研发周期。基于这一mRNA靶向递送技术，星锐医药的管线布局也有相应的特点，针对肝、肺、脾脏都有项目正在推进中。
mRNA疫苗之外的应用
就现有知识来看，递送mRNA是LNPs的最佳应用之一，LNPs潜在的应用场景取决于研发靶向性LNPs的能力。理论上，mRNA可以表达出任意我们想要的蛋白，只要LNPs的靶向性足够好，那么LNPs-mRNA的应用场景将无比广阔。目前除了熟知的疫苗外，通过蛋白替换（表达功能正常的蛋白）、基因编辑（表达编辑系统相关蛋白）手段，LNPs已经在代谢疾病、遗传疾病、癌症等治疗中有所应用。
未来3-5年重点研发方向
当然，想要获得进一步的突破，LNPs技术仍有很多挑战需要克服。未来3-5年，靶向性（靶向特定脏器中特定细胞的能力）研究可能会是LNPs研发的重点方向，这方面的改进一方面可明确提升治疗效果，另一方面也可降低脱靶效应。就SORT技术而言，接下来，我们的首要任务是明确其具体的靶向递送机制及作用机理，这将更有助于指导研发靶向其他重要器官的LNPs体系。
[8] Qiang Cheng et al. Selective organ targeting (SORT) nanoparticles for tissue-specific mRNA delivery and CRISPR–Cas gene editing. Nature Nanotechnology(2022).
[9] https://www.nanovationtx.com/
[10] https://vaxequity.com/
[11] https://aexerna.bio/
[12] https://arcturusrx.com/
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