苯并芘通过芳香烃受体促进肝糖异生相关分子表达

王朝杰1，张梦迪1，2，白图雅1，2，胡玉霞1，2，3，李君1，2，3，王蕾1，苏敏1，杨帆1，4，常福厚1，2

（内蒙古医科大学1.药学院，3.新药安全评价研究中心，内蒙古呼和浩特010110；2.内蒙古自治区新药筛选工程研究中心，内蒙古呼和浩特010110；4.内蒙古科技大学包头医学院第一附属医院，内蒙古包头014010）

摘要：目的探讨苯并芘（BaP）对肝糖异生相关分子的影响及其分子机制。方法①C57BL/6小鼠随机分为正常对照组、溶剂对照组、BaP 0.45，0.90和1.80 mg·kg-1组，将BaP溶解于玉米油中进行ig给药，溶剂对照组ig给予玉米油10mL·kg-1，ig给药连续12周。②取对数生长期的HepG2细胞随机分为细胞对照组、BaP 0.1，1.0和10.0μmol·L-1组，药物孵育细胞24 h。③HepG2分为细胞对照组、BaP 1μmol·L-1、芳香烃受体（AhR）抑制剂CH223191 1μmol·L-1、BaP 1μmol·L-1+CH223191 1μmol·L-1组，药物孵育细胞24 h。细胞免疫荧光检测②③分组HepG2细胞中成纤维细胞生长因子21（FGF21）蛋白水平；实时定量PCR检测①②③分组中小鼠肝组织和HepG2细胞中的肝糖异生相关因子果糖-1，6-二磷酸酶1（FBP1），葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase），磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1（PCK1）和FGF21 mRNA表达水平；Western印迹法检测①②③分组中小鼠肝组织和HepG2细胞中的肝糖异生相关因子FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21蛋白表达水平。结果①与溶剂对照组相比，BaP 0.90和1.80 mg·kg-1组的C57BL/6小鼠肝组织FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21 mRNA和蛋白表达均显著升高（P<0.05，P<0.01）。②与细胞对照组相比，BaP 0.1，1.0和10.0μmol·L-1组HepG2细胞中FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21 mRNA和蛋白表达均显著升高（P<0.05，P<0.01）。③与BaP 1μmol·L-1组相比，BaP 1μmol·L-1+CH223191 1μmol·L-1组HepG2细胞中FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21 mRNA和蛋白表达均显著下降（P<0.05，P<0.01）。结论BaP可提高肝糖异生限速酶FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21 mRNA和蛋白表达，进而提高肝糖异生水平，其机制可能与激活AhR/FGF21信号通路有关。

关键词：苯并芘；芳香烃受体；糖异生；成纤维细胞生长因子21

中图分类号：R992

文献标志码：A

文章编号：1000-3002-（2023）08-0601-08 

DOI：10.3867/j.issn.1000-3002.2023.08.005

糖异生是生物体将多种非糖物质转变成葡萄糖或糖原的过程，对维持空腹状态下血糖正常水平具有重要意义［1］。肝是人体糖脂代谢重要器官，是糖异生或糖原分解产生内源性葡萄糖主要场所，糖异生受一系列转录因子的调控，其中，果糖-1，6-二磷酸酶1（fructose-1，6-bisphosphatase 1，FBP1）、葡萄糖-6-磷酸酶（glucose-6-phosphatase，G6Pase）和磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶1（phospho⁃enolpyruvate carboxykinase，PCK1）是糖异生限速酶，是糖异生途径关键环节［2-5］。成纤维细胞生长因子21（fibroblast growth factor 21，FGF21）是成纤维细胞生长因子家族一员，主要在肝中表达，对肝糖代谢具有重要作用。研究表明，FGF21过表达可促进小鼠肝糖异生，增加肝葡萄糖含量［6］。

肝糖异生异常可导致多种代谢性疾病，与苯并芘（benzo[a]pyrene，BaP）和2，3，7，8-四氯二苯-p-二英（2，3，7，8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin，TCDD）等环境危险因子密切相关。BaP是存在于香烟烟雾中的一种典型的环境污染物，是芳香烃受体（aryl hydrocarbon receptor，AhR）的配体，TCDD和BaP均可诱导AhR下游基因转录，导致毒性作用［7］。研究发现，TCDD可以促进AhR与FGF21启动子直接结合并诱导其表达，说明FGF21是AhR的直接靶标［8］。Hoyeck等［9］发现，暴露于TCDD的小鼠胰岛功能受损，加速了高血糖发生，诱发2型糖尿病（type 2 diabetes，T2D）。此外，实验室前期研究发现，BaP与AhR结合可降低小鼠葡萄糖耐量和胰岛素耐量［10］。但BaP激活AhR后对肝糖异生影响及其机制尚不明确。本研究主要观察BaP通过激活AhR后对小鼠肝和HepG2细胞中FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21表达的影响，探究BaP对糖代谢的作用机制，为防治由环境污染物诱发的糖尿病及代谢性相关疾病提供新的思路。

1材料与方法

1.1主要试剂和仪器

BaP粉末（Sigma公司，美国）；BCA蛋白定量分析试剂盒（Thermo Scientific公司，美国）；总RNA提取试剂盒（DP419）RNA simple Total RNA Kit〔天根生化科技（北京）有限公司，中国〕；反转录试剂盒Rever Tra Ace qPCR RT Kit和荧光定量检测（SYBR Green）试剂盒QPK-201（Toyobo公司，日本）；AhR抑制剂CH223191（MCE公司，中国）；一抗：兔抗小鼠FBP1单克隆抗体、兔抗小鼠PCK1单克隆抗体、兔抗小鼠G6Pase单克隆抗体、兔抗小鼠FGF21单克隆抗体和辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（二抗）（Abcam公司，英国）。DMEM高糖培养基（Gibco，美国）；PBS（碧云天，中国）。

多模式微孔板检测仪（Multiskan Mk3）（Perkin Elmer公司，美国）；冷冻切片机（CM1850）高内涵共聚焦微组织成像系统（PerkinElmer，美国）；组织研磨仪（天根生化科技有限公司，中国）；BIO-RAD基础电泳仪〔伯乐生命医学产品（上海）有限公司〕；荧光定量PCR仪（PiKorea196）和台式高性能离心机（Thermo fisher公司，美国）。

1.2实验动物和细胞

60只4～6周龄C57BL/6雄性小鼠，体重17~23 g（北京维通利华实验动物技术有限公司），动物质量合格证编号：SCXK（京）2020-0006，饲养于内蒙古医科大学新药安全评价中心。饲养环境为SPF级，温度为（24±1）°C，相对湿度（60±5）%，实验动物符合内蒙古医科大学医学伦理委员会标准，伦理批准号为（YKD202002049）。人肝癌细胞株（HepG2）（北京协和基础医学研究所）。

1.3动物和细胞分组及处理

①C57BL/6小鼠普通饲料喂养7 d后，分为5组，每组12只，分别为正常对照组、溶剂对照组（ig给予玉米油10 mL·kg-1）、BaP 0.90和1.80 mg·kg-1组。给药12周后，75%乙醇全身消毒，开胸腔，剪开心包膜，从左心室缓慢匀速推注10 mL生理盐水，直到肝变白，停止推注，取肝。肝组织按照100 mg组织加入4℃预冷组织细胞裂解液800μL，使用电动匀浆器在4℃匀浆，随后4℃4000×g离心5 min，取上清。②HepG2细胞分为细胞对照组、BaP 0.1，1.0和10.0μmol·L-1。③HepG2细胞分为细胞对照组、BaP 1μmol·L-1、CH223191 1μmol·L-1、BaP 1μmol·L-1+CH223191 1μmol·L-1组。取对数生长期的HepG2细胞，均匀铺于6孔板内，加含10%FBS的高糖DMEM培养基后，放入37℃、5%CO2培养箱中培养细胞密度至约60%后，按照分组加入相应浓度药物，以含10%FBS的高糖DMEM继续培养24 h，进行后续实验，重复实验3次。

1.4细胞免疫荧光检测HepG2细胞中FGF21蛋白水平

取生长状态良好的HepG2细胞，均匀铺于12孔板内，取1.3②和③分组的细胞，待细胞汇合度达到约70%开始进行染色步骤。用新鲜配制的30%丙酮+70%甲醇固定液固定细胞10 min。磷酸盐缓冲液（PBS）洗3遍，每次5 min。2%二抗同源血清封闭60 min，染色前加入1抗（抗FGF21，稀释比为1∶250），4℃冰箱孵育，>18 h。PBS洗3遍，每次5 min。避光加入PBS配制的二抗（稀释比为1∶1000），室温（20～35℃)孵育45 min。避光PBS洗4遍，每次5 min。避光加入PBS配制的0.5 mg·L-1 DAPI染色10 min后避光用PBS简单洗3遍，去除多余的DAPI，洗完后加入少量PBS，用高内涵共聚焦微组织成像系统进行拍照，使用Image J软件统计细胞荧光强度表示蛋白表达水平。

1.5实时定量PCR检测肝组织和HepG2细胞中肝糖异生相关分子mRNA表达水平

取1.3①~③分组处理的组织和细胞，使用Trizol试剂提取总RNA，检测RNA纯度及含量，按照逆转录试剂盒说明将RNA逆转录为cDNA，取适量cDNA模板进行qPCR。设定qPCR仪程序为：95℃,30 s，95℃,5 s，60℃,10 s，72℃,15 s，40个循环；计算各组基因mRNA相对表达量（目的基因相对表达量分析方法基于2-△△Ct原理进行）。每个样本平行重复3次，取平均值进行分析。以β肌动蛋白作为内参对照，引物序列见表1。

1.6 Western印迹法检测肝组织和HepG2细胞中肝糖异生相关分子蛋白表达水平

取1.3①~③分组处理的组织和细胞，用PBS将样品洗涤3次，加入含1 mmol PMSF的RIPA裂解液，提取全蛋白。采用BCA蛋白定量试剂盒测得其蛋白浓度。采用10%SDS-PAGE（150 V，2 h）电泳分离蛋白，湿转法将蛋白条带转移至PVDF膜上，用5%脱脂牛奶封闭2 h，加入一抗（抗FBP1、G6Pase，PCK1和FGF21，稀释比均为1∶1000）孵育过夜，冲洗掉一抗，再用二抗（抗β肌动蛋白，1∶1000）孵育1 h，采用增强化学发光法检测蛋白质，采用Image J软件统计积分吸光度值。以目的蛋白条带与内参蛋白条带积分吸光度比值表示目的蛋白相对表达水平。

1.7统计学分析

采用SPSS 20.0软件进行分析。对于符合正态分布的数据采用x±s表示，组间差异采用单因素方差分析法或非参数秩和检验法进行检验，组间比较采用Dunnett t检验，P<0.05为差异具有统计学意义。

2结果

2.1 BaP对HepG2细胞中FGF21蛋白表达的影响

免疫荧光法检测结果如图1和图2所示，与细胞对照组进行比较，BaP 0.1，1.0和10.0μmol·L-1处理HepG2细胞后，FGF21蛋白荧光强度显著升高（P<0.01）。

与细胞对照组相比，BaP组HepG2细胞中FGF21蛋白荧光强度显著升高（P<0.01）；与BaP 1μmol·L-1组相比，BaP 1μmol·L-1+CH223191 1μmol·L-1组HepG2细胞中FGF21蛋白荧光强度显著降低（P<0.05）（图2）。表明BaP通过AhR促进FGF21蛋白表达。

2.2 BaP对小鼠肝组织和HepG2细胞中糖异生相关分子G6Pase，PCK1，FBP1和FGF21 mRNA表达的影响

2.2.1小鼠肝组织

结果如表2所示，与溶剂对照组相比，BaP 0.9和1.80 mg·kg-1组小鼠肝组织中的G6Pase，PCK1，FBP1和FGF21 mRNA表达显著升高（P<0.01），而BaP 0.45 mg·kg-1组小鼠肝组织中的G6Pase，PCK1，FBP1和FGF21 mRNA表达无显著变化。

2.2.2 HepG2细胞

表3结果显示，与细胞对照组相比，BaP 1.0和10.0μmol·L-1组G6Pase，PCK1，FBP1和FGF21 mRNA表达显著上调（P<0.05，P<0.01）。表4结果显示，与细胞对照组相比，BaP组FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21 mRNA表达显著升高（P<0.01），CH223191组无显著变化。与BaP 1.0μmol·L-1组相比，BaP 1μmol·L-1+CH223191 1μmol·L-1组FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21 mRNA表达均显著降低（P<0.05）。

2.3 BaP对小鼠肝组织和HepG2细胞中糖异生相关分子G6Pase，PCK1，FBP1和FGF21蛋白表达的影响

2.3.1小鼠肝组织

Western印迹结果如图3所示，与正常对照组相比，BaP 0.45，0.90和1.80 mg·kg-1组小鼠肝组织中的G6Pase，PCK1，FBP1和FGF21表达水平显著升高（P<0.05，P<0.01）。

2.3.2 HepG2细胞

与细胞对照组相比，BaP 1.0和10.0μmol·L-1组G6Pase，PCK1，FBP1和FGF21蛋白表达水平显著上调（P<0.05，P<0.01）（图4）。图5结果显示，与细胞对照组相比，BaP组HepG2细胞中FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21蛋白表达水平显著升高（P<0.01）；与BaP 1μmol·L-1组相比，BaP 1μmol·L-1+CH223191 1μmol·L-1组HepG2细胞中FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21的蛋白表达均显著降低，差异具有统计学意义（P<0.05）（图5）。

3讨论

本研究结果表明，经BaP处理后不仅能提高肝糖异生相关分子FBP1，G6Pase和PCK1表达，而且能显著增加糖脂代谢关键因子FGF21表达，这一过程需要借助AhR来实现。说明，BaP通过AhR促进了肝糖异生关键酶的活性，干扰了肝正常糖异生的稳态，表现为异常上升糖异生水平。FBP1，G6Pase和PCK1为糖异生限速酶，蛋白和mRNA的表达量可以评估糖异生水平，其对机体血糖稳态十分重要，常作为T2D治疗靶点［11-12］。研究发现，抑制高表达FBP1糖异生限速酶的活性，可以降低肝葡萄糖水平，达到治疗T2D的效果［13-14］。此外，G6Pase和PCK1均与糖尿病密切相关，G6Pase和PCK1的上调，会导致高血糖和T2D，PCK1的持续升高则会造成高胰岛素血症［15-18］。表明，糖异生限速酶FBP1，G6Pase和PCK1的高表达会诱发糖代谢相关疾病。

BaP是AhR经典外源性配体，在无配体存在情况下，AhR和热休克蛋白90、p23、乙型肝炎病毒X相关蛋白2在胞浆中形成无活性复合物［19］。当BaP和AhR结合后，AhR脱离复合物与ARNT形成二聚体，转移到细胞核内，激活下游相关因子如细胞色素P450酶家族［20］。研究发现，AhR在肝中糖原分解、糖异生和脂肪酸氧化中具有重要作用，可通过诱导TiPARP表达影响肝糖异生［21］。FGF21是一种新型糖脂代谢调节靶点，对糖代谢相关疾病和肥胖有着积极的作用，但相对与正常人群而言，肥胖及糖尿病患者血液中FGF21水平却显著上升，这一现象得到了广泛的关注。Fisher等［22］首次发现了FGF21抵抗现象，证实了肥胖小鼠血液中FGF21含量升高，但降低循环中甘油三酯和改善糖耐量生物效应显著减弱。此外，Jeon等［23］发现T2D患者发生FGF21抵抗现象。本研究结果显示，经BaP处理后FGF21表达升高，在给与AhR抑制剂后，FGF21的表达上升趋势被抑制。Girer等［24］研究发现，AhR可与FGF21启动子中的异源物反应元件结合进而影响FGF21表达，说明AhR可直接影响FGF21表达，本研究结果相似，表明BaP能通过AhR/FGF21信号通路，提高肝FGF21含量，并可能引发FGF21抵抗，造成糖脂代谢紊乱。

综上所述，BaP可提高肝糖异生限速酶FBP1，G6Pase，PCK1和FGF21表达，进而提高肝糖异生水平，其机制可能与激活AhR/FGF21信号通路有关，有可能引起FGF21抵抗和相关糖代谢疾病。

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期刊：中国药理学与毒理学杂志 2023年8月 第37卷 第8期

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