被新冠“带货”的外泌体，你了解多少？

外泌体电镜图

前言 /               

雾化吸入的概念一出，外泌体最近火的是一塌糊涂。尤其是本公号推出相关《外泌体雾化能改善小阳人的呼吸道症状？京、沪、鄂三地学者做了一项研究》和《当干细胞遇上新冠，作用机制与临床数据》的研究报道之后，一时间各种整合营销版本遍布行业人的朋友圈。很多吃瓜群众盲目跟风，但您真的了解外泌体吗？鉴于此，本小编将几篇早期科普文章的精华部分整理出来，仅供交流。

外泌体的来源与作用机制

干细胞疗法随着生物医学的发展，慢慢走近了人们的视野。间充质干细胞（Mesenchymal Stem Cell，MSC）在1991年被美国生物学家Aronld Caplan首次在骨髓中分离，是来源于中胚层间充质的一类具有多项分化潜能的成体干细胞。目前研究比较多的MSC主要来源于骨髓、脐血、脐带、外周血和脂肪组织。

1995年，MSC首次作为细胞治疗产品用于人体试验，并快速成为临床研究数量最多的干细胞类型。MSC疗法的神奇功效是由于旁分泌机制介导的，MSC会产生的大量生物活性因子，这些因子在关键的生物过程的调节中发挥重要作用。

作为间充质干细胞旁分泌机制的产物，外泌体在组织修复和再生方面的应用备受关注。[2]外泌体是细胞外微囊泡的一种，直径为40-100nm，能够介导细胞之间的信息交流。外泌体中包含多种生物因子，这些因子在生物的多种生命机理中发挥着重要作用，包括体内稳态、发育、信号传导、免疫调节、炎症、血管生成、细胞凋亡、蛋白质溶解、粘附和细胞外基质组织。外泌体包括各种血清蛋白、生长因子、血管生成因子、激素、细胞因子、细胞外基质蛋白和蛋白酶，以及一些脂质介质和遗传物质。（如图所示）

外泌体及治疗效果示意图

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来源：参考资料[1]

外泌体的组成成分取决于细胞类型和微环境刺激，一般而言，干细胞外泌体对组织修复有疗效，包括促进血管生成、抗凋亡、抗纤维化、抗炎和免疫调节作用。除了可以避免直接使用细胞潜在的风险外，干细胞外泌体的临床应用优势还在于其易扩增、易获得和易长时间保存。

科学家使用蛋白质组学揭示了人体间充质干细胞外泌体有助于血管再生的潜能。这项研究对于缺血损伤组织的治疗意义重大，为促进组织血管生成，增加组织成功抢救的几率以及防止组织纤维化。相关成果发表在《自然》杂志。

研究论文

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来源：参考资料[1]

研究人员首先通过液质联用法分析出人体间充质干细胞外泌体的组成成分，通过蛋白质组学发现间充质干细胞外泌体中富含与血管生成过程相关的成分。通过分析三种组织的间充质干细胞（脂肪组织、骨髓、脐带华通氏胶）的外泌体发现，针对血管生成这一目的，人体脐带华通氏胶中的分泌库显示了更完整的血管生成网络以及更高浓度的相关蛋白；其次是骨髓间充质干细胞外泌体；脂肪间充质干细胞外泌体中则缺乏相关蛋白，且大多检测到的蛋白表达水平明显降低。

与人体脂肪间充质干细胞外泌体相比，骨髓间充质干细胞外泌体和脐带华通式胶间充质干细胞外泌体明显功能性要强一些，CD14⁺⁺和CD16^-单核白细胞的迁移率明显更高，增强巨噬细胞的分化能力，并且可以更强的诱导血管内皮细胞生成血管。

结果表明，人体脐带间充质干细胞是炎症介导的血管生成诱导中最有效的外泌体来源。通过这样的系统分析，对未来临床研究选择不同MSC有指导意义。

免疫细胞的对人体不同组织的间充质干细胞答应

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来源：参考资料[1]

人体间充质干细胞外泌体在体内外实验中均观测到促血管生成作用。

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来源：参考资料.[1]

当然，来自不同组织的间充质干细胞中分泌的因子的数量和浓度不同，间充质干细胞的组织来源明显影响外泌体的功能。脂肪间充质干细胞外泌体中包含的胰岛素样生长因子（IGF-1）、VEGF-D和IL-8水平高于骨髓间充质干细胞外泌体，其他因子如VEGF-A、bFGF、SDF-1和血管生成素的表达水平接近。

文章指出，2006年，国际细胞治疗协会（ISCT）定义了多能间充质干细胞的最低标准，但并未考虑不同组织来源的间充质干细胞在蛋白质组学和功能方面的差异。

上面的报道结果也强调了优化MSC的特征参数的必要性，以便更好的对比MSC的临床研究和实验室研究结果，而且还需要为不同组织来源的MSC外泌体定义分子标记，同时还需要考虑不同体质人群供体中干细胞的差异，如年龄、性别和健康状况等特征。并且还需要考虑获取干细胞的伦理问题。

间充质干细胞外泌体疗法是干细胞治疗的一大趋势：

-可以避免干细胞治疗的一些缺陷（免疫排斥、伦理问题等），

-并且外泌体具有高稳定性、易储存、无需增殖、便于定量使用以及想损伤处募集等优势；

-外泌体因其包含多种蛋白和RNA，比使用某种单一的细胞因子具有较高的安全性和更大的组织再生潜能。

因此，MSC外泌体在组织再生中具有极大优势。但是，因其提取方法及复杂的分类系统阻碍了干细胞外泌体的应用。

外泌体高效提存技术成为临床应用亟需解决的重要问题。同时，外泌体调节免疫以及促进组织再生的最佳浓度，以及外泌体的半衰期也需要更深入的研究。

如何辨别与获取干细胞外泌体？

从细胞液中有效地提取并获得完整的外泌体，是开展外泌体研究的前提与关键。当前外泌体的分离方法通常包括超速离心法、聚合物沉淀法、体积排阻与超滤法、免疫亲和捕获法和微流体芯片技术等，见下表。

外泌体的不同提取方法的优点与缺点

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来源：参考资料[2].

01 超速离心法 

又称差速离心法是外泌体分离的标准方法，其一般步骤是先使用亚微米过滤器或低速离心法去除细胞碎片，微泡或凋亡小体；随后，以多次100000×g或更高的速度进行超速离心以消除大囊泡并使外泌体沉淀下来；最后去除上清液，在相对较少体积的缓冲液里重悬外泌体，从而得到用于研究的外泌体样品。该方法虽然成本不高，但最终所得外泌体纯度低，且需要进行再提纯，回收率不稳定，故其是一个耗时耗力的过程。最近也有实验将超速离心法与蔗糖密度梯度离心法组合起来用于分离低丰度外泌体。

02 聚合沉淀法 

目前常用的是System bioscience(SBI)研发的ExoQuickTM试剂盒，其原理是在4℃下将聚合物沉淀剂与样本共同孵育30min，低速离心后获取沉淀并用PBS重悬后获取外泌体。因为其操作简单且不需要额外的实验设备，在近年来饱受青睐。由于这些试剂需要过夜处理且可能存在非外泌体材料的污染和其他蛋白与聚合物的共沉淀，所以会对后续的实验分析有一定的干扰性。

03 尺寸排阻色谱法与超滤法 

这2种方法均以分子大小为基础进行分离。尺寸排阻色谱法可用于血浆样品及细胞培养上清液的外泌体分离，利用装填的多孔性材料色谱柱不仅可去除大多数的白蛋白和免疫球蛋白，而且洗脱分离的外泌体在形态上是完整的，非聚集的和有功能性的。

最新研究证实使用尺寸排阻层析和密度垫超速离心结合的方法来分离血液中细胞外囊泡，能显著改善细胞外囊泡与脂蛋白的分离情况，从而允许研究者对血浆外泌体的蛋白质组进行详细分析，使得血液成为发现外泌体生物标记物的可行来源。超滤法是利用截留不同相对分子质量的聚醚砜超滤膜对样品进行系统性分离从而获取外泌体。

04 免疫亲和捕获法 

此方法是基于外泌体特异性膜抗原与抗体特异性结合进行外泌体分离，包括酶联免疫吸附实验分离法和抗体包被的免疫磁珠法。基于免疫亲和原理，研究者在分离外泌体的实验中使用ExoELISA-ULTRA完整试剂盒，即通过CD63(一种常见的外泌体标志物)进行酶联免疫吸附分离得到了来自脐带血内皮祖细胞中的外泌体。磁珠法虽具备特异性高、操作简单且实验中始终维持外泌体完整形态等优点，但所分离的外泌体容易被环境中的酸碱度干扰，限制了广泛推广。

05 微流体芯片技术 

这是一项新兴的技术，具有低耗容、效率快和高灵敏度等优点，在外泌体分离和分析方面拥有着广泛前景。Marczak等就在实验中提出了一种新的微流控技术，通过使用压力驱动流将样品输送至微流体芯片，利用横向电场迫使它们离开交叉流并进入琼脂糖凝胶，从而过滤掉不需要的细胞碎片，而离子选择性膜通过富集效应将外泌体浓缩。这项既可以分离又可以富集回收外泌体的技术，可能会在将来早期癌症的检测中发挥重要作用。

除此之外，随着生物技术的快速发展及人们对外泌体的深入了解，不断出现分离外泌体的新方法与技术，如利用亲和性膜离心柱分离方法可从外泌体中高效分离RNA，这种方法允许一次性处理较大体积的样本(最多4mL)来有效探测低丰度RNA。与传统超速离心法不同，这种技术能快速获得稳定的外泌体且可在敏感的下游得到应用。因此有理由相信越来越多分离外泌体的方法必将有效促进外泌体的深入研究和临床应用程度。

外泌体分离后进行有效鉴定是开展后续的研究或临床应用的前提与基础。目前对于外泌体的鉴定，主要方法包括流式细胞术、透射电子显微镜成像、生物免疫如SDS-PAGE/Western blot/抗体阵列技术和动态光散射技术。为避免单一技术的缺陷，研究者通常联合几种方法，同时结合外泌体的特性进行外泌体的鉴定。

然而，需要指出的是外泌体的保存环境与保存时间对维持外泌体直径及完整性同样至关重要。有研究指出6个月内存储在-20℃环境下的外泌体即使反复冻融多次也不会发生结构变异，而4℃和37 ℃环境下储存的外泌体却存在结构降解的风险。

另一项研究发现在24h内，外泌体最佳的储存温度为4℃，此时较高的温度和冻融循环可能会影响外泌体膜结构并改变其特性，引起外泌体浓度的降低；而长期储存时，-80℃的低温环境更有利于维持外泌体的完整性；然而，该实验结果还表明酸性储存环境会降低外泌体的浓度，这与其他文献中报道的酸性pH可减少外泌体相关蛋白的降解结果相矛盾，故环境pH值对外泌体的影响值得进一步研究。

作为一种新的治疗手段，间充质干细胞源性外泌体治疗在临床应用过程中依然面临诸多挑战，例如需不断改进和标准化外泌体分离纯化方法，确保外泌体的临床应用安全性；增强临床应用的可比性和重现性等。

外泌体的应用场景

01 药物投递载体

传统药物往往存在水溶性差、易被人体快速清除、生物相容性差、体内分布不理想和向细胞渗透能力低等缺陷，这些问题在一定程度上限制了它们的临床应用。药物投递系统就是要解决上述一个或多个问题以达到增加药物的安全性和效果的目的。外泌体作为药物载体进行药物运输有独特的优势，主要体现在：

（１）当使用自源外泌体时，外泌体引起的有害免疫反应极低；

（２）外泌体在人血液中的稳定性好；

（３）向细胞转运“货物”的效率高；

（４）外泌体运载药物时具有一定的靶向性；

（５）外泌体直径在40～100nｍ之间，因此可以很好地利用增强渗透滞留（EPR）效应，有选择性地渗入到肿瘤或者炎症组织部位。

如下图所示，正常组织附近的血管，内皮细胞排列相对紧密，因而外泌体几乎不会通过血管渗透出去；而肿瘤组织附近的血管，内皮细胞间隙大，外泌体可通过细胞间间隙透出血管，并滞留于肿瘤组织处，从而实现对肿瘤的被动靶向作用。

外泌体利用EPR效应对肿瘤的被动靶向

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来源：参考资料[3].

近年来，抗癌类药物的运输成为癌症治疗的关键问题，引起了各个领域研究者的关注。药物载体层出不穷，基于脂质体的载体和基于聚合物的载体是两类目前广泛研究的药物载体，然而这些载体往往存在着血液中循环时间短，易被人体清除，稳定性差，靶向性低等问题，因此，需要一种新型的可以有效运输药物的载体。

外泌体作为细胞分泌的纳米级别的小泡，在细胞间信息交流的过程中起着重要作用，并且它在人体内分布广泛，可以穿过细胞膜，不易引起免疫反应，作为药物载体具有独特优势，为基因、抗肿瘤等药物的运输开辟了一条新的道路。

02 治疗皮肤衰老与美容

已有研究证明干细胞衍生出的外泌体能影响细胞的自我愈合，并且在消除细胞毒素方面具有一定作用。

目前，外泌体疗法最吸引力的应用场景是皮肤美容。人类皮肤会随着时间的推移、皮肤重要成分的再生能力减弱，从而出现衰老的物理迹象（例如皱纹、色斑等）。外泌体可以在细胞水平上发挥作用，促进皮肤细胞再生。

在临床前研究中，发现外泌体可有效地用于延迟皮肤老化。能促进成纤维细胞的再生。成纤维细胞对保持皮肤的弹性和强度至关重要。虽然尚未对人类进行研究，但在部分西方国家，外泌体已经被用于抗衰老诊所的面部护理项目中，市面上也有含外泌体的保湿剂。

一些医美机构提供微创的面部服务，利用微针和外泌体产品（外泌体、生长因子、透明质酸和微RNA），帮助刺激愈合和再生新皮肤。联合皮肤填充剂（玻尿酸）在面部护理和拉皮手术中使用，以帮助提升和丰满下垂的皮肤，美容师可以使用微针注射方式将外泌体产品移植到问题皮肤区域。

在治疗过程中，常使用外泌体注入受损组织来实现细胞再生。一般使用的外泌体产品包含从人类捐赠者围产期组织中的间充质干细胞（MSCs）或基质细胞分离中获得。这类来源的外泌体产品包括生长因子、透明质酸和微RNA，以及细胞因子和趋化因子（两种支持细胞信号传导的蛋白质），它们共同帮助组织愈合和再生。

外泌体抗衰老治疗已在一定程度上被证明可以：

- 恢复面部轮廓和形状，看起来更年轻；

- 提高皮肤质量、质地和色调；

- 减少色素沉着和晒斑；

- 减少细纹和皱纹；

- 改善皮肤的紧致度。

受损皮肤示意图

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来源：https://evexiasmedical.com/

外泌体与干细胞疗法的区别

如果把干细胞比作“物流站“，那外泌体完全可以用“快递员“来形容。

干细胞治疗涉及使用整个细胞来取代老化或有缺陷的细胞。而外泌体是指从细胞中分离出来的囊泡，学术机构通常把它称为“细胞信使“，这些囊泡小包裹中包含的很多影响其他细胞行为的重要物质。

虽然外泌体可以来自任何类型的细胞，但再生医学中研究较多的外泌体仅来源于发育中的胚胎（胚胎干细胞）和骨髓、脐带、血液（成人干细胞）和脂肪组织，而肿瘤干细胞中的外泌体在癌症诊断中也有涉及。

另外，外泌体不是用异体细胞来取代个人的细胞，理论上来讲，只是影响和促进原本细胞功能的提高和自我修复。与干细胞治疗相比,外泌体生物技术的主要优势是接受者的排斥的风险最小，故有望比干细胞更加快速的走入临床应用当中。

小编叨叨

近两年来，外泌体在细胞行业中炒得火热。对于如何分辨外泌体，吃瓜群众一知半解，目前，这个技术更多的被用在延缓衰老和药物递送的研究中，从“外泌体“护肤品到药物传递，如今再次被证实对呼吸系统症状有一定作用。

也许在不远的将来，科学界将研发出更多被改造后的外泌体，它们搭载着抗衰老及化学药物，精准“轰炸“衰老细胞，靶向清除肿瘤细胞，让我们健康长寿。

参考资料：

【1】干细胞的 “最佳拍档” -- 外泌体，你真的了解吗？

【2】连载｜间充质干细胞外泌体-如何辨别与获取

【3】身为细胞“屎尿屁”的外泌体，真的能治愈衰老？

【4】外泌体在皮肤衰老中的作用与进展

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