科学实锤！NK免疫细胞远比人们想象的要强大，它的分泌物也可抗癌

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NK细胞可以识别应激诱导的配体，并通过一组激活和抑制受体的MHC I类表达的变化来广泛识别癌细胞。靶细胞可以被NK细胞内溶细胞颗粒释放的颗粒酶和穿孔素等溶细胞蛋白迅速杀死，或通过较慢的Fas-FasL依赖性途径被杀死。

NK细胞凭借其强大的抗肿瘤能力，已被成功应用于多项使用单倍体或同种异体NK细胞或CAR-NK细胞的临床试验，用于对抗血液癌症。然而，实体瘤的NK细胞疗法更难实现，部分原因是它们浸润肿瘤的能力较低。

NK细胞可以释放含有溶细胞蛋白的细胞外囊泡（EV），因此可以规避以上这种问题。之前的研究表明，来自NK细胞的大量细胞外囊泡（NK-EV）含有溶细胞蛋白，可以诱导多种肿瘤细胞系的凋亡。

但是，NK-EV诱导肿瘤细胞死亡的确切机制尚不清楚。不过，细胞外囊泡似乎可以表达几种激活受体，例如DNAM-1和NKG2D以及FasL，这些受体可以介导与肿瘤细胞的接触并诱导细胞凋亡。

另外，NK细胞释放的细胞外囊泡可能异质性非常高，因为囊泡可以从质膜或不同的细胞内区室释放出来。因此，探索其释放对于理解其异质性也十分关键。

来自挪威奥斯陆大学的科学家在《Frontiers in Immunology》发表了题为“Isolation of a cytolytic subpopulation of extracellular vesicles derived from NK cells containing NKG7 and cytolytic proteins”的研究论文，他们采用了分级分离方案来富集细胞溶解性NK细胞外囊泡，发现含有溶细胞蛋白的细胞外囊泡主要通过溶细胞颗粒释放。

论文首页截图

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在这项研究中，他们从人NK-92细胞系或原代人NK细胞的培养基中收获了NK-EV。通过将超速离心与下游密度梯度超速离心（DG-UC）或尺寸排阻色谱相（SEC）相结合，鉴定出不同的细胞外囊泡群体。

随后，他们通过无标记定量质谱和蛋白质印迹试验对不同的细胞外囊泡分离物进行了表征，发现其中一个亚群主要富集质膜蛋白和四跨膜蛋白CD37、CD82和CD151，并且可能代表微泡。

另一个主要亚群富含细胞内衍生的标志物，具有高表达的内体四跨膜蛋白CD63和细胞内细胞器标志物。

从IL-15刺激的NK-92细胞的48小时条件培养基中分离NK-EV的工作流程，以及鉴定出的不同细胞外囊泡群体

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来源：Aarsund, M., et al. 2022

细胞内衍生的细胞外囊泡富含溶细胞蛋白，并且对HCT-116结肠癌球具有高凋亡活性。先前的研究已经证明大量NK-EV会诱导肿瘤细胞凋亡，因此接下来他们比较了DG-UC或SEC获得的不同级分中的细胞外囊泡群体诱导的细胞凋亡。

为了测试HCT-116球的凋亡，他们注入了20µg细胞外囊泡，并通过IncuCyte在48小时内实时监测HCT-116球中的胱天蛋白酶3/7活性。

结果证实了细胞毒性蛋白的蛋白质印迹数据，DG-UC的细胞外囊泡群体6和SE的细胞外囊泡群体4以不同的方式诱导了细胞凋亡。

A：细胞凋亡的实时监测。B：应用不同的细胞外囊泡后24小时HCT-116肿瘤球的代表性图像

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来源：Aarsund, M., et al. 2022

为什么细胞外囊泡亚群存在这样的差异图谱而且功能不同呢？为了探究这些差异，他们对不同的组分进行了比较蛋白质组学图谱分析。果不其然，DG-UC细胞外囊泡群体5-7的主成分分析表明，这三个群体具有不同的蛋白质图谱。

简言之，DG-UC方法分离得到的细胞外囊泡显示出蛋白质组的明显差异，表明存在具有不同功能和来源的细胞外囊泡。

DG-UC或SEC产生的NK-EV亚群的比较蛋白质组学分析

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来源：Aarsund, M., et al. 2022

为了进一步富集溶细胞细胞外囊泡，他们通过免疫亲和力方法分离出了含有溶细胞颗粒标记NKG7和大部分囊泡颗粒酶B含量的细胞外囊泡子集。

总之，这项研究对通过DG-UC（NK-92或原代NK细胞）或SEC（NK-922细胞）分离的细胞外囊泡亚群进行了比较分析，表明可以将大部分质膜衍生的细胞外囊泡与细胞内来源的细胞外囊泡分离出来。

仅用细胞内来源的细胞外囊泡可以观察到肿瘤细胞凋亡的诱导，而用来源于质膜的细胞外囊泡则没有观察到。未来还需要进一步开发提高溶细胞细胞外囊泡产量的实验方案，因为这将有助于将细胞外囊泡用于癌症治疗。

除了直接分离提取细胞外囊泡并注入肿瘤用于治疗外，细胞外囊泡还能在肿瘤治疗中发挥其他功能吗？

来自美国哥伦比亚大学的科学家及其合作者发表了题为“Extracellular Vesicles as Biomarkers in Cancer Immunotherapy”的综述文章，总结了在癌症免疫治疗之前、期间和之后诊断和监测患者的非侵入性方法，以及在临床环境中利用细胞外囊泡进行癌症免疫治疗所面临的挑战。

论文首页截图

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癌症的发生和进展高度依赖于周围微环境的性质，包括细胞和非细胞成分。细胞外囊泡充当细胞之间通信的运输代理并调节肿瘤微环境，支持性基质对于转移前微环境中肿瘤的发生至关重要。

肿瘤源性细胞外囊泡含有多种肿瘤新抗原，并包含反映肿瘤潜在遗传复杂性的独特分子特征。因此，它们有可能成为癌症免疫治疗的新型微创生物标志物。

肿瘤微环境中的细胞外囊泡细胞间通讯

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来源：Mathew, M., et al. 2020

基于细胞外囊泡的生物标志物发现存在诸多挑战，其一为细胞外囊泡异质性和疾病不同阶段的变化，这需要对研究队列进行密切监测和表征。

对于细胞外囊泡生物标志物的临床应用，有效的细胞外囊泡生物标志物量化方法和临床试验中靶点参与的证据是必要的。因此，开发有效的基于细胞外囊泡的癌症生物标志物需要很长时间，并且需要在临床环境中进行重大优化和验证。

当前基于细胞外囊泡的癌症生物标志物开发面临的挑战，以及克服这些挑战的策略

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来源：Mathew, M., et al. 2020

综上所述，NK细胞的细胞外囊泡有着巨大的肿瘤治疗潜力。另外，来自肿瘤的细胞外囊泡也可以在免疫治疗的不同环节发挥作用。不过，还需要进行更多的临床试验来进行完善和支持。

参考资料

[1].  Aarsund, M., Nyman, T. A., Stensland, M. E., Wu, Y., & Inngjerdingen, M. (2022). Isolation of a cytolytic subpopulation of extracellular vesicles derived from NK cells containing NKG7 and cytolytic proteins. Frontiers in Immunology, 13, 5267.

[2].  Mathew, M., Zade, M., Mezghani, N., Patel, R., Wang, Y., & Momen-Heravi, F. (2020). Extracellular vesicles as biomarkers in cancer immunotherapy. Cancers, 12(10), 2825.

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作者：古古古

审校：南风 | 咏彤

声明：本文仅作为科普，拒不接受商业用途的转载申请，亦不构成任何建议。

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