Nat. Commun. | snRNA-seq和snATAC-seq解析成人肾组织细胞构成异质性和损伤发病机制

原创梁伟明华大时空 2023-07-02

收录于合集

美国华盛顿大学的研究人员使用单细胞核转录组(snRNA-seq)和染色质可及性分析(snATAC-seq)研究了成人肾组织细胞的异质性和肾病发生的细胞生物学机制，其成果于2021年4月发表在Nature communications 上，以下为详细解读。

文章题目：Single cell transcriptional and chromatin accessibility profiling redefine cellular heterogeneity in the adult human kidney

发表时间：2021-04-13

发表期刊：Nature communications

主要研究团队：华盛顿大学

影响因子：14.919

DOI：10.1038/s41467-021-22368-w

研究背景

肾脏由不同亚群的细胞组成，单细胞测序可以高分辨率地分析肾脏组织细胞构成的异质性。有研究表明，近端小管和肾小囊中某些基因在急性肾损伤后高表达，但由于细胞的稀疏性，阻碍进一步的探索。此外，肾髓质和皮质升支粗段之间存在结构和功能差异，但是驱动这些差异的信号通路和调控机制尚不明确。

单细胞染色质可及性分析可用于构建人类肾脏的单细胞表观基因组图谱，辅助细胞亚型的鉴定，研究其在促进或抑制肾脏修复和再生中的作用，并帮助进一步更好地理解肾单位的功能调控，进而对于认识急慢性肾脏疾病的机制和开发诊疗技术都具有重要意义。

研究样本

样本：5位未明显显示肾小球硬化或间质纤维化和肾小管萎缩的病人，3名男性和2名女性。

采样区域：肾皮质区域

图1 基本分析流程图

研究方法

对收集得到的样本，进行细胞核分离、核酸提取以及文库制备，分别进行snRNA-seq和snATAC-seq测序和生信分析，然后做单细胞核转录组和单细胞核染色质可及性联合分析，鉴别肾组织的特定细胞类型。对特定的细胞类型，通过建立小鼠模型，来探索不同疾病（急性和慢性）中异质性和功能影响。

研究成果

1. 单细胞核转录组产出情况

对5个样本snRNA-seq 测序，每个文库平均有 3997 ± 930 个细胞核，每个细胞核平均检测到 1674 ± 913 个基因，共获得 19,985 个细胞核，聚类和注释分析表明覆盖了肾皮质内的所有主要细胞类型。

图2 snRNA-seq细胞类型图谱

2. 单细胞核染色质可及性产出情况

每个 snATAC-seq 文库平均有 5408 ± 1393 个细胞核，每个核平均检测到 7538 ± 2938 个峰（peak）。最终的 snATAC-seq 文库在 27,034 个细胞核中总共包含 214,890 个独特的峰值区域(peak)，覆盖了肾皮质内的所有主要细胞类型。

图3 snATAC-seq 细胞类型图谱

3. 整合snRNA-seq和snATAC-seq分析，预测和验证染色质可及性细胞类型分配

对snRNA-seq数据进行注释，通过标签转移锚定的方法，来预测snATAC-seq的细胞类型。对snATAC-seq数据集细胞类型，根据97%置信阈值进行筛选，以去除异型双重数据。snATAC-seq的基础聚类注释能够检测到近曲小管簇中的两个亚群，分别是PCT（近曲小管）和PST（近直小管）。这说明了snATAC-seq和snRNAseq综合多模式分析提高了鉴别细胞异质性的能力。

图4 多组学整合预测snATAC-seq细胞类型图谱

4. 染色质可及性定义细胞类型

从snATAC-seq得到27,034个细胞中检测到214,890个可及性染色质区域（peak），对该数据集进行过滤，保留至少10%的细胞核包含的区域，其中大约85%的区域与肾小球或肾小管间质中的DHS（肾小球和肾小管间质DNA酶I超敏位点）重叠。这说明了snATAC-seq是检验成人肾脏可及性染色上可靠的方法。同时发现，大多数DAR（差异可及性染色质区域）位于距离最近的转录起始位点3kb以内的启动子区域。

图5 差异可及性区域的调控元件堆积比例图

例如：LRP2在近端小管中表达的谱系特异性，其启动子和基因体内的ATAC峰数量和幅度在PT细胞中(包括PCT，PST，PT_VCAM1等)显著增加。

图6 DAR表达热图与LRP2启动子表达峰图

DAR不一定调节最近的基因，可以通过长程相互作用进行远端调控区域关联。长程相互作用通过染色质结合介导增强子和启动子之间的关联，并且部分受转录因子调节。

5. 染色质可及性与细胞类型特异性转录因子活性和染色质相互作用网络有关

跟据DAR与基序（motif）的结合情况，可以预测单个细胞类型的转录因子“活性”，即单个细胞类型可通过转录因子“活性”来定义，表明细胞类型特异性转录因子可能调节染色质可及性。

1）HNF4A编码一种关键转录因子，可驱动近端小管分化。chromVAR检测到HNF4A在远端小管上活性增加，染色质可及性增加，基因表达量增加;

2）转录因子TFAP2B在集合管和升支粗段上活性增加，染色质可及性增加，基因表达量增加。

图7 motif活性热图及HNF4A和TFAP2B表达分析

使用R包Cicero来预测单个细胞类型的顺式调节染色质相互作用。特定顺式共可及性网络(Cis-coaccessibility networks, CCAN)存在可及性协作改变和相互作用的关系，可用于预测染色质相互作用。

图8 顺式共可及性网络分析

结果表明，在近曲小管中，大多数Cicero连接位于启动子区域内或启动子与另一位置之间。

转录因子可以作为激活因子或抑制因子，分为三组构建数学模型：

1）在基序活性和基因表达之间表现出显著正相关（n = 38）；

2）表现出负相关（n = 11）；

3）表现出不相关（n = 403）。

结果发现，糖皮质激素受体基因（NR3C1）在基序活性和表达之间呈正相关，而盐皮质激素受体基因（NR3C2）呈负相关。

图9 相关性分析

然而，NR3C1 和 NR3C2 是密切相关的类固醇激素，具有几乎相同的结合基序。推测，它们可能调节细胞特异性，在肾单位中具有不同的生物学功能。

6. 单细胞水平的等位基因特异性表达

使用pseudo bulk pre-mRNA数据集，以检测近端小管中的ASE（等位基因特异性表达），分析了221个基因，并鉴定了62个ASE。其中，16个（n=16/62，25%）仅在PT特异性表达，这表明等位基因特异性偏差可能在特定的细胞类型中富集。

7. 多模态分析突出了升支粗段中的细胞异质性

对snRNA-seq数据集中的升支粗段进行无监督聚类，识别出三组细胞。

1）第一组细胞（SLC12A1+UMOD+）表达升支粗段标记基因（CLDN16、KCNJ10和PTH1R): TAL1；

2）第二组表达另一组TAL特异性标记基因，如CLN10 : TAL2；

3）第三组细胞根据先前发表的标记基因表达（S100A2）被鉴定为升支细段（ATL）。

图10 snRNA-seq中TAL的细胞类型图谱以及基因表达分析

分析了snATAC-seq数据集中的升支粗段cluster，并确定了三组与在snRNA-seq数据集中的发现对应的细胞类型，这些结果表明升支粗段亚群可以通过单细胞转录组或染色质可及性图谱来定义。

图11 snATAC-seq中TAL的细胞类型图谱以及基因表达分析

8. NF-κB调节VCAM1的近端小管亚群的分子特征

通过免疫荧光研究发现了一组微管细胞（命名为PT_VCAM1），主要在近端小管，VCAM1的表达和色素可及性增加了。有研究表明肾损伤分子1（KIM1，HAVCR1）是一种在急性肾损伤和慢性肾损伤中的生物标志物，即使在没有肾损伤的样本中PT_ VCAM1 群体也显示KIM1的表达增加。确定PT_VCAM1细胞的一个子集在免疫荧光分析中表达 CD24 或 CD133。

图12 免疫荧光分析验证

用 Monocle进行了伪时间排序，以确定哪些基因驱动从健康的近端小管向 PT_VCAM1 状态的转变。结果表明，VCAM1 和 TPM1是在 PT_VCAM1 细胞中表达增加的基因， SLC5A12 和 SLC4A4 的表达减少。

图13 snRNA-seq轨迹分析

用Cicero构建了一个互补的伪时间序列，以检测从PT到PT_VCAM1过渡期间染色质可及性的变化。发现VCAM1和TPM1的转录增加，与VCAM1基因内和启动子区域内染色质可及性增加有关；同样，SLC5A12和SLC4A4转录的减少与染色质可及性的降低有关。

图14 snATAC-seq轨迹分析

通过评估ChromVar转录因子活性，确定了可能调节近端小管和PT_VCAM1之间转换的转录因子。结果表明：近端小管显示出HNF4A的强大活性，在PT_VCAM1中HNF4A的活性降低，与REL和RELA的活性增加一致。

图15 RELA和HNF4A montif分析

NF-κB是一个诱导转录因子家族，在REL结构域中具有同源性，与肾脏疾病的炎症反应有关。结果发现，与PT相比，PT_VCAM1中差异基因的基因集富集分析在影响NF-κB信号的通路，发现与缺血再灌注损伤诱导的急性肾损伤激活NF-κB和抑制NF-κB可改变肾功能具有一致性。

从VCAM1基因体中鉴定出一个约60kb的开放染色质区域，该区域包含一个RELA基序，预测该基序将与VCAM1启动子相互作用（通过顺式共可接近网络）。

9. PT_VCAM1的比例在急性肾损伤和慢性肾病中升高

对从小鼠缺血再灌注（IRI）实验中获得的bulk RNA-seq数据进行去卷积，结果发现PT_VCAM1的估计比例在IRI术后24小时显著增加，并持续至少7天；相应地，正常近端肾小管细胞比例在下降。然后，在老年小鼠中，非手术对照小鼠肾脏中PT_VCAM1的估计比例增加了，并伴随着白细胞的增加。这说明PT_VCAM1的出现在衰老相关的慢性炎症和小管损伤中起作用。

图16 IRI中 PT_VCAM1的分析

接着，使用同样的方法分析了2型糖尿病患者肾活检中的bulk RNA-seq数据。与对照组或早期糖尿病肾病患者相比，晚期糖尿病肾病患者的PT_VCAM1比例显著升高，这表明PT_VCAM1和肾小管损伤可能与糖尿病肾病的疾病进展有关。

图17 糖尿病中PT_VCAM1的分析

总结

此研究为对肾组织的单细胞核转录组和单细胞核染色质可及性图谱分析，发现了近端小管和升支粗段的细胞亚型以及功能特异性。发现大多数差异染色质调控区域定位于启动子，并且大部分与差异表达的基因密切相关。通过研究转录因子结合基序的细胞类型特异性富集，发现了NF-κB 的激活，在促进 VCAM1 表达并驱动近端小管上皮细胞亚群之间的转变。

最后，通过PT_VCAM1的比例在急性肾损伤和慢性肾病中变化分析，表明PT_VCAM1的出现在衰老相关的慢性炎症和肾小管损伤中起作用，并且PT_VCAM1和肾小管损伤可能与糖尿病肾病的疾病进展有关。

本研究中提供的数据来源：

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE151302 https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE131882

代码来源：

https://github.com/p4rkerw/Muto_Wilson_NComm_2020

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