植物逆境胁迫下的分子机制大揭秘 | 时空简讯29期
时空简讯第29期。
植物的逆境胁迫通常分为非生物胁迫（干旱、盐渍等）和生物胁迫（病原体感染等）。各种逆境胁迫会严重植物的生长发育，植物会在分子、细胞、器官等水平上及时做出响应，以适应逆境条件。在此，本期遴选了10篇有关植物逆境胁迫和生长机理的文章，以供了解参考。
非生物胁迫
Abiotic Stress
植物磷酸盐响应过程中活体单细胞水平转录动态监控
Nature Plants [IF: 15.793]
① 通过进行磷（Pi）饥饿和Pi再弥补实验，收集拟南芥根和叶在Pi再弥补的30、 60、80 min后的样本进行RNA-seq，并用逆转录定量PCR（quantitative PCR with reverse transcription，RT-qPCR）进行结果验证，最终选择出2个在Pi匮乏状态下高水平表达，且在缺磷/磷充足变化中表现出广泛动态变化的基因：SPX1和UNI1（Unicorn1），同时鉴定到快速下降的22个转录本是受几个关键蛋白转录控制的，包括PHR和SPX家族。
② 通过构建pSPX1::MS2x128转基因拟南芥株系，进行磷处理基因表达量分析，并与单分子荧光原位杂交（smFISH）和内源探针信号进行对比，SPX1启动子驱动下的MS2可以真实地反映SPX1基因表达的时空表达情况。
③ 运用旋转盘共聚焦显微镜，对信号最强的pSPX1::MS2x128转基因拟南芥株系进行报告基因表达情况分析，并同时进行smFISH和MCP-GFP成像，发现MCP-GFP检测到的90%~95%的位点都可被MS2 smFISH标记，证明MS2-MCP系统在整个植物组织中均是一个强大而敏感的转录成像系统。
④ 使用探针测量转录位点的亮度，并用可见的单分子来计算活性转录位点上新生RNA分子的绝对数量，发现pSPX1::MS2×128拟南芥转基因株系在转录位点平均有37个分子；对报告基因的多聚A位点进行荧光检测，发现拟南芥中基因转录是快速且连续发生的。
⑤ 对每个细胞的活性等位基因数量进行定量分析，同时测量具有不同活性转录位点的细胞中所有转录位点之间的距离，发现转录位点不是随机分布，是连续的；通过比较二倍体根冠细胞的单细胞不同等位基因的活性，发现大量细胞只有一个活性的转录位点或完全没有转录，存在由于基因破裂导致不连续转录的现象；相同细胞之间基因表达的差异受基因表达噪声的影响，在转录过程中，细胞内生化反应影响下的内部固有噪声比细胞周期或信号通路传导影响下的外部噪声影响大。
⑥ 使用简化版的RootChip微流控系统结合可以快速改变磷酸盐溶液能力的活细胞成像技术，并采用了旋转圆盘显微镜，持续地观察到去Pi溶液导致SPX1启动子的破裂，而转录位点在几分钟内开始和停止。同时Pi再补给的转录抑制也是迅速的，表明Pi触发的调控级联具有敏感性和快速性的特点。（姜小花）
MS2-MCP系统的工作原理
Live single-cell transcriptional dynamics via RNA labelling during the phosphate response in plants.
2021.08.09, DOI: 10.1038/s41477-021-00981-3
研究文章；（植物）时空技术，生命机理；拟南芥，RNA成像系统，磷酸盐响应，smFISH, SPX1, MS2, MCP-GFP; Sahar Hani , Laura Cuyas, Pascale David, Edouard Bertrand, Laurent Nussaume; Aix Marseille Univ, Agroinnovation International-TIMAC AGRO, Univ. Montpellie; France.
拟南芥幼叶对轻度干旱胁迫应答的单细胞转录组特征与代谢机理
Plant Physiology [IF: 8.005]
① 从正常和轻度干旱环境下生长的拟南芥（Arabidopsis thaliana）幼叶中分离出单个细胞，进行高通量scRNA-seq，得到了1,887个叶片细胞，平均（中位数）表达2,017个基因，鉴定出14个主要叶片细胞群，包括叶肉、维管和表皮等核心组织以及具有独特身份或代谢活性的亚群，构建了高质量的单细胞转录组图谱，并表征出表皮、叶肉和维管组织等的发育特点与胁迫响应的代谢机理。
② 幼叶的单细胞分析，发现表皮细胞的发育具有极性梯度的特点，定义了表皮细胞的近远轴亚群和保卫细胞，发现一小群表达典型近轴标记基因CHS的远轴表皮细胞，揭示查尔酮（chalcone）作为两种途径的中间产物，在叶片两侧合成的梯度差异。
③ 9种不同的细胞群形成拟南芥主要的维管组织，发现暴露在轻度干旱胁迫下的叶片在硫代葡萄糖苷代谢过程（glucosinolate，GSL）中具有空间分离和功能差异的特点，强调代谢途径不同分支之间空间差异分布的可能性。
④ 胁迫水平、细胞分裂阶段和极性可以区分不同发育阶段的叶肉细胞，叶肉细胞对土壤水势的变化最敏感，筛选出仅在叶肉中由干旱诱导表达的组织特异性基因CALEOSIN 3 (AT2G33380）和COLD REGULATED 15B (AT2G42530) 等。
⑤ 基于整合的单细胞图谱提供一个直观的网页工具：https://bioit3.irc.ugent.be/plant-sc-atlas/，有助于深入了解不同的拟南芥细胞群体是如何通过发育、代谢或与压力相关的通路相互连接和作用。（徐晓静）
scRNA-seq和最终注释揭示拟南芥叶片的单细胞转录组图谱
Single-cell transcriptomics sheds light on the identity and metabolism of developing leaf cells.
2022.02.04, DOI: 10.1093/plphys/kiab489
研究文章；（植物）生命机理；拟南芥，叶片，胁迫应答，代谢，scRNA-seq; Rubén Tenorio Berrío, Dirk Inzé, Marieke Dubois; Ghent University, VIB Center for Plant Systems Biology; Belgium.
轻度干旱会影响细胞分裂和细胞扩增之间的转变以限制玉米叶片生长
Plant Biotechnology Journal [IF: 6.305]
① 研究导致转变区（transition zone，TZ）正向（过表达GA20OX-1）或者反向调控（轻度干旱调控）的条件，进一步了解了玉米叶片中动态调控细胞分裂到细胞扩增转变的分子过程。
② 通过过表达赤霉酸（gibberellic acid，GA）生物合成相关基因GA20-OXIDASE（GA20OX-1OE）获得的高水平GA株系GA20OX-1OE会将TZ向叶子的上部迁移，而与低水平GA相关的轻度干旱处理会导致TZ在叶片基部；仅仅增加GA水平，GA20OX-1OE株系不足以克服这轻度干旱处理的影响，表明除了低水平的GA之外，存在其它的机制在干旱条件下限制生长。
③ 比较轻度干旱处理和GA20OX-1OE株系的高空间分辨率的转录组数据，发现轻度干旱处理特异地诱导转录调控重编程，降低分裂区的光合作用，并在TZ延长细胞分裂。
④ 开发了一个在线搜索工具“Leaf Growth Viewer”（https://psblgv01. psb.ugent.be），可以查询轻度干旱胁迫和高GA水平下玉米叶片生长区的转录组变化。（南措吉/Lina）
注：生长是细胞分裂与细胞扩增两者间的相互作用，在玉米叶片的生长区中，这两个生物学进程分别起作用。
The reduction in maize leaf growth under mild drought affects the transition between cell division and cell expansion and cannot be restored by elevated gibberellic acid levels.
2017.09.04, DOI: 10.1111/pbi.12801
研究文章；（植物）生命机理；玉米，叶，细胞分裂，赤霉酸，轻度干旱，时空转录组，Transcriptome analysis, Dirk Inzé, Department of Plant Systems Biology VIB - Ghent University; Belgium.
生物胁迫
Biotic Stress
植物免疫系统的生命周期
Critical Reviews in Plant Sciences [IF: 6.235]
① 介绍了植物病原体的感知和毒性，以丝状病原体、细菌病病原体为例介绍了植物病原体的入侵策略，并认为病原体在面对植物免疫系统之前，已经获得了抑制宿主即将发生的防御反应的能力。
② 从局部和远端免疫信号激活的角度概述了植物个体防御事件的发展，并利用效应触发免疫（effector-triggered immunity，ETI）模型和动力学假设机制描述了局部免疫信号激活时机及传递过程；基于水杨酸（salicylic acid，SA）和茉莉酸（jasmonic acid，JA）的信号传导模型，研究描述了防御激素作为信号分子在感知病原体后发挥的重要作用。
③ 总结了个体发育调节基因和环境微生物群对整个植物免疫系统的发育和调控，包括与年龄相关的抗性和免疫系统的发育、自体遗传调控控制的免疫系统的发育，以及相关有益微生物群对植物免疫系统的作用。（衣丽芳）
植物免疫系统的发育同时受到自身基因和共生微生物群的调控
The life cycle of the plant immune system.
2020,05.18, DOI: 10.1080/07352689.2020.1757829
综述文章；（植物）疾病病理；泛植物，免疫系统，病原体，入侵，免疫信号，信号传导；Pai Li, Brad Day; Michigan State University; USA.
时空转录组技术揭示植物免疫超敏反应的转录标志物
Molecular Plant [IF: 21.949]
① 利用拟南芥-丁香假单胞菌病理系统，通过比较空间（IN区、OUT区）时间（0、1、2、4和6 h post-inoculation）分辨率下植物免疫死亡细胞及其周围细胞的基因表达差异，揭示了超敏反应（hypersensitive response，HR）的时空转录特征：IN区（5,495个DEGs）基因表达变化远大于OUT区（1,785个DEGs），两者基因上调主要发生在4、6 hpi，前者主要富集到免疫相关过程，后者富集到激素相关过程，特别是JA信号通路。
② 将实验组IN和OUT区基因表达谱聚类为3个簇，发现IN区光合基因受到转录抑制，而OUT区光合作用几乎没有因病原体感染所改变，推测存在一个相对功能齐全的光合机制可能是维持防御机制和防止发生HR的周围细胞死亡的关键。
③ 基于时间、区域和处理之间的两两比较生成了一个流程（pipeline），筛选出13个IN区特异性高表达的基因作为HR标记基因，通过实时荧光定量PCR进行标记基因验证；标记基因的功能涉及离子运输跨质膜（M1）、细胞解毒（M2和M3）、脂质代谢（M5和M6）、细胞壁重塑（M7、M8和M9）、蛋白质降解（M10）和糖酵解（M11和M12）。
④ 利用标记基因构建融合表达载体，其中AT5G17760基因（M13）启动子构建的报告体系显示出最清晰的GFP信号。使用其他菌株和灰孢杆菌测试该HR报告系统，表明该体系可响应多种病原体介导的不同类型的NLRs（nucleotide-binding leucine-rich repeat immune receptors）的激活。（Yuki）
实验设计示意图
Robust transcriptional indicators of immune cell death revealed by spatio-temporal transcriptome analyses.
2022.05.02, DOI: 10.1016/j.molp.2022.04.010
研究文章；（植物）疾病病理；拟南芥，叶片，丁香假单胞菌，空间转录组，植物免疫，超敏反应，模式触发免疫，效应触发免疫，细胞死亡标志物；Jose Salguero-Linares, Irene Serrano, David Rengel, Nuria S. Coll; Centre for Research in Agricultural Genomics (CRAG), Universitat de Barcelona, Université de Toulouse; Spain, France.
scRNA-seq揭示藻类-病毒互作的动态转录调控程序
Science Advances [IF: 13.116]
① 对核质巨DNA病毒 (Nucleocytoplasmic large DNA viruses，NCLDVs) 感染后0~24 h的赫氏圆石藻（Emiliania huxleyi）进行scRNA-seq分析，同时设置感染组、对照组和UV模拟感染组，试图解析病毒基因的动态变化和调控过程，以及在转录水平上的改变。
② 随着感染时间变长，单个细胞内宿主和病毒转录本趋于主导，只有少数细胞处于中间状态，造成病毒-宿主的转录本比例骤然下降；而病毒基因的平均表达水平随着时间推移而升高，病毒UMI（unique molecular identifiers） ≥10的细胞比例在10 h内从0%升高至约90%，表明病毒通过接管整个mRNA池大量转换细胞转录组。
③ 根据病毒基因表达的相似性将单个细胞分为关联组（metacells），共得到7个关联组分别对应不同的感染阶段，具有一定连续性。大部分的病毒基因分布在5个活跃的类别中，分别为immediate-early（73个基因）、early（136个基因）、early-late（49个基因）、late 1（22个基因）和 late 2（40个基因），每个类别中的多数基因都表现出高度相似的表达情况；功能分析发现在immediate-early、early和early-late类型中主要由RNA聚合酶调控。
④ 纯化病毒粒子后，利用LC-MS方法对病毒蛋白的组成进行分析，结合上述5个类别，发现大多数的病毒粒子是由late1、late2编码的，表明病毒利用这些活跃的类别基因暂时调控产生病毒的组成元件，且病毒基因组中保守的调控机制也在支持这些活跃类别发生作用。
⑤ 对核、叶绿体和线粒体基因进行功能分析，发现叶绿体编码的基因在感染早期阶段仍然保持活跃，这与最近的研究发现——病毒感染依赖于光的结果一致；与TCA循环和氧化磷酸化相关的线粒体蛋白基因维持在一个高水平以保证线粒体重要代谢途径的顺利运行；rRNA转录本直到感染中期都保持着数量的上升，这表明翻译过程起到一定的推动作用。（陈海霞）
scRNA-seq研究NCLDVs感染赫氏圆石藻试验的示意图
A single-cell view on alga-virus interactions reveals sequential transcriptional programs and infection states.
2020.5.20, DOI: 10.1126/sciadv.aba4137
研究文章；（植物）疾病病理；藻类，赫氏圆石藻，单细胞转录组，病毒感染，感染机制，动态变化，scRNA-seq; Chuan Ku, Uri Sheyn, Shilo Rosenwasser, Assaf Vardi; Weizmann Institute of Science, The Hebrew University of Jerusalem; Israel.
病毒性病灶的转录组学分析揭示免疫信号基因的空间调控并确定RBOHD是马铃薯病毒Y和马铃薯之间不亲和互作的重要参与者
The Plant Journal [IF: 6.141]
① 研究了马铃薯Ny-1基因对马铃薯Y型病毒的免疫网络应答，从生物化学和基因表达水平上分析了细胞死亡区和周围组织的免疫应答过程，揭示了免疫应答的时空调控；分析水杨酸（salicylic acid，SA）耗竭的NahG植株的响应，评估出SA在信号级联中的位置。
② 细胞死亡区和周围组织的超微结构特征不依赖于SA，而转录应答依赖于SA；在SA缺失的细胞系中，一些基因的时空调控完全缺失，而其他基因表现出不同的应答，表明激素信号模块之间存在多重联系。
③ NADPH氧化酶RBOHD表达的诱导在抗性应答过程中特异性地发生在病变边界；在RBOHD沉默的植物中，抗性应答的功能受到干扰，病毒的扩散不会在感染部位被阻止；RBOHD是SA空间积累所必需的，相反，RBOHD受SA的转录调控。
④ 利用空间分辨RNA-seq，还识别了一种UDP-葡萄糖基转移酶的空间调控，这是SA生物合成反馈激活的另一个成分，从而破译了抗性信号传导的一个新方面。（王倩倩/Lina）
SA的合成和RBOHD通过一个调节反馈回路相互连接
Precision transcriptomics of viral foci reveals spatial regulation of immune-signaling genes and identifies RBOHD as an important player in the incompatible interaction between potato virus Y and potato.
2020.09.01, DOI: 10.1111/TPJ.14953
研究文章；（植物）疾病病理；马铃薯，马铃薯病毒Y，免疫信号网络，RBOHD，活性氧种类，水杨酸，病毒抗性，时空调控, RNA-Seq; Tjaša Lukan, Maruša Pompe-Novak, Špela Baebler; National Institute of Biology; Slovenia.
生长机理
Growth Mechanism
拟南芥根部油菜素类固醇作用的单细胞形态转录组图谱
Molecular Plant [IF: 13.164]
① 结合数字3D单细胞图谱和scRNA-seq，在briTRIPLE（bri1、brl1、brl3三个受体缺失）和briT-RESCUE（在原生韧皮部维管分子特异的子叶维管模式2启动子控制下，携带BRI1-CITRINE转基因融合蛋白位点）两个突变株及野生型拟南芥的根组织中，分别获得了5,767、6,724、5,061个高质量单细胞数据，探究油菜素类固醇的信号转导作用。
② 油菜素类固醇信号既不影响根的细胞体积也不影响细胞增殖能力，但其缺失会造成靠近根部静止中心（quiescent center，QC）的细胞更短更宽，过早地停止细胞分裂活动，从而降低分生组织的各向异性，也会影响细胞分裂的精准走向。
③ 油菜素类固醇信号可以通过非细胞自主功能（non-cell-autonomous functions），使邻近的和较远的不产油菜素类固醇的细胞增殖到标准的组成结构，这足以使得植物恢复生长活力。
④ scRNA-seq数据表明，油菜素类固醇依赖的根细胞形态和生长方向，与编码阿拉伯半乳糖蛋白（arabinogalactan protein，AGP）的基因表达强烈相关，干扰AGPs的活性会导致根细胞更短更膨胀，从而缺少各向异性的根细胞。即AGPs可以被当作油菜素类固醇依赖的根细胞各向异性的“哨兵”。（陈海霞）
A single-cell morpho-transcriptomic map of brassinosteroid action in the Arabidopsis root.
2021.07.29, DOI: 10.1016/j.molp.2021.07.021
研究文章；（植物）生命机理；拟南芥，根，单细胞转录组，油菜素类固醇信号转导；Moritz Graeff, Christian S. Hardtke; University of Lausanne; Switzerland.
水稻中GA-OsGRF7/8模块调控细胞分裂区大小来决定叶片长度
The New Phytologist [IF: 10.323]
① 选取栽培稻（叶片较小的籼稻IR64、粳稻Nip）和野生稻（叶片最长的野生O.australiensis 、中间长度的O. glaberrima），对4个品种水稻叶片长度的变异进行转录组学分析，同时结合细胞生物学和分子生物学的研究方法，揭示了赤霉酸（gibberellic acid，GA）及其下游转录因子OsGRF7-OsGRF8通过调节细胞分裂区的大小决定了水稻叶片的长度。
② 对叶片发育的细致表型变化和遗传特征进行定量分析，发现在不同出苗期野生稻叶片的长度均显著长于栽培稻。同时转录组测序分析表明，细胞周期、GA、转录因子（OSGRF7和OSGRF8）是水稻叶片长度调节的关键因素。
③ 野生稻中GA4的含量显著高于栽培稻，且其含量与叶片的长度呈高度正相关性。对特定区域GA合成和信号转导基因的表达进行分析，发现较高的GA含量通过增加分裂区的大小从而促进叶片的长度。
④ OsGRF7和OsGRF8在叶片的分裂区和伸长区的表达模式与GA合成和信号转导基因的表达模式相似，而外源性GA处理能够明显诱导分裂区和伸长区OsGRF7和OsGRF8的表达。
⑤ 在野生稻和栽培稻中，通过瞬时沉默的方法分析GA合成酶基因GA20OX2，以及GA信号转导抑制子SLR1、GRF7、GRF8对叶片长度的调控功能，确认通过GA和下游OSGRF7和OSGRF8转录因子可调节细胞区域大小，以控制稻叶长度。（寒鹤）
GA-OsGRF7/8模块调控细胞分裂区大小来决定叶片长度
Spatial control of cell division by GA-OsGRF7/8 module in a leaf explaining the leaf length variation between cultivated and wild rice.
2022.03.03, DOI: 10.1111/nph.18029
研究文章；（植物）生命机理；水稻，栽培稻，野生稻，叶片，细胞分裂，赤霉酸，生长调节因子；Vikram Jathar, Aashish Ranjan; National Institute of Plant Genome Research, Aruna Asaf Ali Marg; India.
R2R3-MYB基因控制着柳叶菜科细长山字草（Clarkia gracilis）的花瓣色素沉积模式
The New Phytologist [IF: 10.151]
① 利用转录组分析、基因表达分析、F2植物[将白色与无斑点（spots）的粉红色Clarkia gracilis ssp. Sonomensis(Onagraceae)杂交得到]共分离和功能测试，研究了彩色背景下导致未着色花瓣元素进化的遗传变化，鉴定了C. gracilis ssp花青素生物合成途径中的酶编码基因和相关转录因子，确认最近的基因复制对于C. gracilis ssp花瓣色素沉积模式的进化至关重要。
② 识别了一个负责花瓣基部区域（“cup”）花青素色素沉积的R2R3-MYB转录因子（CgsMYB12），CgsMYB12的一个功能突变在粉红色花瓣背景下形成了一个白色cup；此外，还发现2个R2R3-MYB基因（CgsMYB6和CgsMYB11）也参与花瓣背景色素沉积。
③ 以上3个R2R3-MYB基因中的每一个都表现出不同的时空表达模式，其中CgsMYB6在整个花瓣中表达，且在所有花芽发育阶段均有表达；而CgsMYB11和CgsMYB12是在花瓣的互补区域表达的，前者仅在花瓣背景中表达，后者仅在粉红色cup中表达，二者均到发育后期才表达。
④ C. gracilis ssp花中的两种图案元素（花瓣斑点和白色cup）都很有可能是由SRD机制（最近的基因复制之后亚功能化；recent gene duplication followed by subfunctionalization）进化而来的；基因树表明，CgMYB1C（控制斑点形成）、CgMYB11和CgMYB12（调节花瓣背景色素沉积）组成了一个非常密切相关的同源基因分支，正如在SRD机制下所预期的那样。（张书琪）
C. gracilis ssp花瓣色素沉着和基因表达示意图
R2R3-MYB genes control petal pigmentation patterning in Clarkia gracilis ssp. sonomensis(Onagraceae).
2020.09.29, DOI: 10111 / NPH.16908
研究文章；（植物）生命机理，生命进化；Clarkia gracilis ssp. Sonomensis(Onagraceae)，花，花青素，色素沉淀，基因复制，花瓣模式，R2R3-MYB转录因子，时空表达；Rong-Chien Lin, Mark D. Rausher; Duke University; USA.
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