Science | 蝾螈的细胞类型分析揭示脊椎动物前脑进化的创新

基于前面对在Science 同期发表的两篇关于蝾螈大脑发育和再生文章的解读（Science | Stereo-seq鉴定蝾螈端脑再生过程中的重要神经干细胞亚型；Science | 蝾螈端脑组织、神经发生和再生的单细胞分析），我们知道了蝾螈大脑具有一定的再生能力，理解了其大脑如何再生，为何再生能力如此强大。此外，先前研究表明，脊椎动物认知功能的演化与前脑的两项关键创新有关：哺乳动物的六层新皮层，以及蜥形类（包括爬行动物与鸟类）的背侧室嵴（dorsal ventricular ridge，DVR），但它们的产生过程尚不清楚。

在此，美国哥伦比亚大学等研究团队利用scRNA-seq技术对欧非肋突螈（Pleurodeles waltl）大脑的四个发育阶段进行分析，构建了欧非肋突螈端脑的单细胞转录组图谱，以及不同脑区细胞的发育轨迹。并通过与爬行类、哺乳类动物的大脑数据的比较，发现蜥形类的一部分DVR的出现要追溯到四足动物祖先，而欧非肋突螈却不具备哺乳动物新皮层的细胞与分子特征。以下是文章的详细解读。

文章题目：Cell-Type Profiling in Salamanders Identifies Innovations in Vertebrate Forebrain Evolution

发表时间：2022-09-02

发表期刊：Science

主要研究团队：美国哥伦比亚大学、瑞典卡罗林斯卡学院瑞典隆德大学等

影响因子：63.714

DOI：10.1126/science.abp9186

研究背景

在脊椎动物进化过程中，第一批从水生过渡到陆生的四足动物面临着新的环境挑战，所以需要在神经系统方面进行适应性创新。这些创新分别体现在哺乳动物大脑的六层新皮质结构和蜥形类（爬行动物和鸟类）DVR结构。基于目前研究，新皮质和背腹嵴在基因表达、连接性和功能方面有广泛的相似性，因此被认为是共同起源的。然而，基于近期一些有关发育和成体基因表达数据的研究表明，类似的分子和功能特性可能是通过趋同进化产生的，而不是共同的起源的结果。基于这个观点，如果新皮质和DVR有不同的起源，那它们在祖先物种中应该可以追溯到大脑的不同皮质区域。而两栖类动物大约于3.5亿年前从四足动物中分化出来，是相对于爬行类和哺乳类更古老的一个分支，因此可以为四足动物大脑的进化提供关键的数据和见解。

研究样本

成年（5~19 个月龄）欧非肋突螈（Pleurodeles waltl）的全脑和端脑（显微解剖）；欧非肋突螈幼体不同发育阶段的端脑样本：stage 36、stage 41、 stage 46和stage 50。

研究策略

首先，利用scRNA-seq分析成年欧非肋突螈和不同发育阶段的欧非肋突螈的端脑样本，结合生物信息学分析及ISH、HCR（hybridization chain reaction）和神经逆行追踪实验方法，系统解析欧非肋突螈端脑的细胞类型和脑区分布。然后，分析不同发育阶段欧非肋突螈端脑细胞的发育轨迹，揭示大脑皮质不同区域细胞的发育轨迹以及相应调控基因的表达变化。再者，与爬行类动物（鬃狮蜥、海龟）和哺乳动物（小鼠）端脑的单细胞数据进行整合比较分析，重点分析了共聚类（co-clustering）的细胞簇，比较它们的分子特征、转录调控等的差别和相似性，从而推断不同区域的起源进化关系。最后，利用在欧非肋突螈大脑皮质的不同区域注射逆行神经示踪剂的方法，比较了欧非肋突螈神经连接与爬行类、哺乳动物的差异和相似性。

研究成果

1. 欧非肋突螈端脑的单细胞转录组图谱

研究人员利用scRNA-seq首先构建了成年蝾螈端脑的单细胞图谱，共获得了36,116 个细胞，并通过marker基因对单细胞进行了注释分类（图1C、1D）。然后，通过神经元的pan-marker基因鉴定其中的神经元细胞，最终获得29,294 个神经元细胞，降维聚类后共得到114 个神经元细胞亚群，其中47簇属于谷氨酸能神经元，67簇属于γ-氨基丁酸能神经元（GAGBergic）（图1E）。

图1 欧非肋突螈端脑的神经元多样性

2. 欧非肋突螈大脑皮质的分区和细化

以往研究表明，两栖动物的大脑皮质组织沿中外侧轴划分为四个区域：内侧、背侧、外侧和腹侧（MP、DP、LP和 VP），但是精确的边界或进一步分亚区还是不确定的。所以研究人员基于获得的欧非肋突螈端脑单细胞数据和marker基因，对分区进行了验证（图2A、2B）。然后，通过ISH实验对各分区的marker在组织切片上进行原位杂交，来进一步明确分区及边界（图2C、2D）。最后，利用杂交链式反应HCR和免疫组化（IHC）实验对端脑分区进行3D呈现。最终，研究人员构建了一个两栖类动物大脑皮质的转录组分子图谱（图2E），并确定了沿内外侧轴存在不同区域和沿径向轴存在不同层的存在。

图2 欧非肋突螈大脑皮质神经元的空间定位

3. 欧非肋突螈大脑皮质中神经元的发育轨迹

 为了追踪欧非肋突螈大脑皮质中神经元的发育轨迹，研究人员收集欧非肋突螈幼体四个发育阶段（stage 36、41、46和50）的端脑并进行scRNA-seq分析（图3A），最终获得20,26个细胞，并对其进行UMAP降维聚类和细胞周期分析（图3B）。然后，将成年欧非肋突螈的scRNA-seq数据映射到幼体发育阶段的数据上，观察到幼体中包含了来自于成年大脑皮质和下皮质所有主要区域的神经元类型（图3C）。接着，通过marker基因Neurog2鉴定出祖细胞，用Slingshot软件推断出大脑皮质祖细胞分化为MP、DP、LP和VP的轨迹 （图3D、3E）。最后，分别对在背侧和腹侧大脑皮质发育轨迹中差异表达的基因进行热图展示（图3F），发现DP和VP轨迹中上调的调控因子是不同的，说明DP和VP中的神经元应该由不同的基因调控信号通路调节形成，有各自的发育程序。

图3 欧非肋突螈端脑的发育轨迹

4. 欧非肋突螈、爬行动物和哺乳动物神经元类型之间的分子相似性

为了比较四足动物端脑神经元类型的分子特征，识别蝾螈、爬行动物和哺乳动物中具有相似表达谱的神经元，研究人员首先通过对欧非肋突螈、鬃狮蜥和海龟的大脑皮质数据进行共聚类分析，得到65个clusters，并明显分成谷氨酸能神经元和γ氨基丁酸能神经元两大类（图4A~C）。通过此分析，研究人员观察到很多个共聚类（co-clustering）的clusters，比如欧非肋突螈的MP与爬行类的内侧皮层、VP与外侧皮层（图4D）。爬行动物aDVR（anterior DVR）与欧非肋突螈VP共聚类到一起，包含6个clusters（31、3、13、58、17、30）。其中，cluster13中同时包含了来自于欧非肋突螈VP区域的细胞和爬行动物（L+T）aDVR区的细胞（图4E）。cluster3和cluster13共享多个转录因子，比如Tbr1、Nr2f2、Nr2f1和Lmo3（图4F）。总之，两栖类VP和爬行类aDVR包含有相同分子特性的神经元及相同的进化史。

图4 欧非肋突螈、鬃狮蜥和海龟端脑神经元细胞的跨物种比较

接下来，研究人员用Allen小鼠脑图的原位杂交数据计算与欧非肋突螈细胞clusters之间的基因表达的相关性（图5A），确认了下皮质区域与小鼠对应区域有一定的分子相似性，而大脑皮质区的对应关系却较为模糊。采用上述相同的整合方法，将欧非肋突螈、鬃狮蜥、海龟和小鼠的数据整合进行聚类分析，同样观察到多个共聚类的clusters（图5B），比如欧非肋突螈的γ氨基丁酸能中间神经元与鬃狮蜥、海龟和小鼠的中间神经元聚为一个cluster（图5C），表明这些中间神经元可追溯到四足动物的祖先。同时，研究人员发现了一些保守的类型，如cluster13，以及哺乳动物特异的类型，如cluster50。通过marker表达分析，研究人员发现区分哺乳动物中间神经元Lamp5 ndnf和Lamp5 Lhx6的转录因子在非哺乳动物中Lamp5细胞中共表达，说明羊膜或哺乳动物特异性Lamp5类型是通过祖先Lamp5中间神经元的多样性分化而来的（图5D）。

图5 欧非肋突螈与爬行动物和小鼠的皮质细胞图谱整合比较

在小鼠特有的细胞簇中，研究人员识别出新皮质丘脑和L5椎体神经元，表明这些神经元类型具有独特的表达谱，是哺乳动物中新的类型（图5E）。进一步比较欧非肋突螈DP、海龟DC与小鼠皮质各区域在整合clusters中的比例，研究人员发现大多数蝾螈DP与来自小鼠海马、内嗅皮层和下托的神经元共聚类（图5F~H）。而分析转录因子表达发现共聚类的clusters除共享转录因子Bcl11b、Sox5表达外，其它转录因子在每个cluster中的表达都有差异。以上表明，欧非肋突螈DP缺乏哺乳动物新皮质（neocortex）的细胞和分子特征。

5. 欧非肋突螈大脑皮质神经的连接性研究

研究人员通过逆行追踪实验，在欧非肋突螈端脑不同部位注释神经示踪剂BDA，来追踪神经元之间的连接（图6A~C）。通过该实验，研究人员观察到VP有来自于LPa和aOB的信号，推测其有嗅觉处理的功能，同时发现VP有来自于中央丘脑（Th）信号的投射，与前期研究结果一致（图6A）。

结合前人关于爬行类神经连接的研究，研究人员最终发现两栖类的VP和爬行类的aDVR连接模式有相似性，推测爬行类的aDVR神经元可能是从两栖类的VP神经元进化而来的。哺乳动物大脑的嗅觉-内嗅-海马体（olfactory-entorhinal-hippocampal）回路部分可以回溯到四足动物的祖先，对应于欧非肋突螈背侧和外侧大脑皮质中。总之，爬行类和哺乳动物大脑皮质发生了创新事件，产生了新的神经元类型（图6D）。

图6 欧非肋突螈大脑皮质神经连接研究实验及大脑进化关系示意图

结论

研究人员首先通过对欧非肋突螈端脑进行scRNA-seq分析，生成了蝾螈端脑的单细胞图谱，揭示其细胞和分子的多样性和复杂性。并基于细胞聚类注释结果，利用免疫组化和原位杂交方法确认了蝾螈大脑皮质的分区。然后，基于四个发育时期的欧非肋突螈端脑的数据，研究人员对大脑皮质进行发育轨迹分析，描述了大脑皮质组细胞分化为MP、DP、LP和VP的轨迹。

接着，将欧非肋突螈端脑单细胞数据与鬃狮蜥、海龟（爬行）和小鼠（哺乳）的单细胞数据进行整合比较，研究人员发现欧非肋突螈VP区域与爬行动物aDVR有分子相似性；欧非肋突螈端脑DP、MP与哺乳动物海马体、内嗅皮层和下托有一定的分子相似性，说明它们可能是共同起源的。最后，研究人员通过神经示踪剂实验分析了欧非肋突螈的神经连接模式，证实欧非肋突螈VP连接模式部分类似于爬行动物aDVR。但爬行类和哺乳动物大脑皮质发生了创新事件，产生了新的神经元类型。

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