结直肠癌分子标志物临床检测中国专家共识
摘要
结直肠癌是目前我国发病率及死亡率最高的恶性肿瘤之一。随着精准医疗理念及对肿瘤相关分子标志物研究的逐年深入，合理的检测及应用结直肠癌相关分子标志物已经成为目前临床实践的重要部分。为了提高临床医师对结直肠癌分子标志物的了解及应用，中国临床肿瘤学会（CSCO）结直肠癌专家委员会组织相关领域专家，根据近年的国内外临床研究及实际诊疗经验，经专家组反复修改讨论，撰写了结直肠癌分子标志物临床检测的专家共识，旨在为临床医师提供参考及指导，为结直肠癌患者提供更加精准、有效的治疗。
结直肠癌是人类最常见的恶性肿瘤之一，全球发病率居恶性肿瘤第3位，死亡率居第2位。在我国，结直肠癌发病率亦呈现逐年上升趋势。根据2019年国家癌症中心数据显示，2015年中国结直肠癌新发病例38.8万，死亡病例18.7万。结直肠癌的早期筛查及预防可以降低发病率、提高治愈率，相关分子标志物的检测是结直肠癌筛查的有效补充，同时对个体化方案的判定、预后判断及疗效预测等方面起到重要作用。本共识综合国内相关领域专家临床实践经验及国内外相关领域的研究成果，旨在为结直肠癌分子标志物的临床检测及临床实践提供规范及指导。
本共识对结直肠癌治疗中与方案选择和预后判断有关的分子标志物的检测标本、检测方法以及检测结果的解读提供了指导意见。其中每个分子标志物检测的适应证和时机见图1。
图1 结直肠癌分子标志物检测的适应证与时机
目前在临床中，用于结直肠癌分子标志物检测的标本来源主要为患者的肿瘤组织标本以及外周血标本，其中外周血标本又涵盖了外周血有核细胞、血液无细胞液体成分及循环肿瘤细胞（circulating tumor cell，CTC）。肿瘤组织检测可反映肿瘤的体细胞突变，而外周血标本中，血有核细胞的基因检测代表患者的胚系突变，CTC基因检测代表的是肿瘤的体细胞突变，而血液无细胞液体成分中的循环无细胞DNA（circulating free DNA，cfDNA）既可能源自肿瘤细胞，也可能源自血有核细胞。
1．肿瘤组织标本：
肿瘤组织标本中具有较富集的肿瘤细胞，可更真实地反映肿瘤中基因的变异情况，但由于无法区分突变是体细胞突变还是胚系突变，因此不能用于遗传性疾病如林奇综合征的诊断。肿瘤组织样本又可根据其来源分为原发灶样本和转移灶样本。对于结直肠癌相关KRAS、NRAS和BRAF基因的突变，在原发灶样本和转移灶样本中的一致性非常高。
2．外周血标本：
外周血有核细胞标本能明确反映胚系突变情况，可用于遗传性患者的诊断。但外周血有核细胞不能反映肿瘤组织的体细胞突变，无法帮助临床预测相关药物的治疗效果。外周血有核细胞标本基因检测时要注意CTC可能带来的干扰。
转移性结直肠癌（metastatic colorectal cancer，mCRC）既往的基因检测标准方法是组织活检，但存在若干缺点，包括人体侵入性、获得样本的技术难度较高等。近年来，微侵入性的液体活检技术显示出良好的应用前景。对外周血进行分离纯化后可以检测CTC或者cfDNA。cfDNA是指游离于血液中的细胞外DNA，主要来源于衰老、凋亡的血细胞和肿瘤细胞释放的片段化DNA，因此可以表达来自肿瘤的DNA。循环肿瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA）是肿瘤细胞凋亡后进入血液的游离DNA，是cfDNA的一种，其监测或能更早地预测疾病复发；为术前新辅助治疗及术后辅助治疗的疗效评估提供参考。但目前尚缺乏特异性验证和可靠的重复试验。
目前，cfDNA的液体活检仍处于探索阶段，尚存在较多问题和挑战。外周血中ctDNA的含量较低，分离和纯化ctDNA具有一定难度，ctDNA在cfDNA中的占比较小，正常血细胞来源的DNA同样会对检测结果造成干扰。cfDNA在血液中的半衰期仅1.0~2.4 h，因此标本的取样、制备和存储等环节均有较高难度，极易造成结果不准确。此外，样本较易受到外部因素影响而不能正确反映患者肿瘤中的突变情况。因此，目前cfDNA液体活检仅推荐作为临床研究探索性应用。
此外，CTC也是外周血标本中的重要部分。CTC是从原发或继发肿瘤脱落进入循环的肿瘤细胞。因循环中的肿瘤细胞分布相对稀少，CTC的检测过程主要分为两步，即细胞的分离富集和富集细胞的鉴定。目前，CTC及相关分子标志物检测的临床应用仍在探索中，可能对于疾病的早期筛查、预后判断和疗效评估有一定作用。
（四）基因变异类型
1．点突变：
在RAS和BRAF基因突变检测时，至少要包含KRAS和NRAS基因的第2、3、4号外显子及BRAF基因的V600E位点。
2．插入突变：
遗传易感基因BRCA1和BRCA2基因编码区（包括BRCA1外显子2，3，5-24；BRCA2外显子2-27）及外显子-内含子链接区、UTR区和启动子区的插入突变。
3．缺失突变：
BRCA1部分内含子20和外显子20跳跃造成的异常剪接。
4．基因融合：
结直肠癌中新兴的生物标志物NTRK基因融合。
5．基因扩增：
Her-2基因扩增。
6．基因缺失：
遗传易感基因TP53、RB1等基因缺失。
（五）检测结果
1．IHC报告的模板及重点参数：
当以IHC作为检测方法时，应注明样本来源、抗体的克隆号以及蛋白表达的百分比。
2．PCR报告的模板及重点参数：
PCR报告应包括样本来源、肿瘤细胞比例、使用方法、检测位点及范围、突变丰度和基因变异的解读。
3．NGS报告的重点参数：
（1）报告基本信息：
检测名称及编号：如"结直肠癌基因变异检测报告CRC201900001"；
患者基本信息：姓名、年龄、性别和住院号等；
样本信息：病理号、取材部位、样本类型[经甲醛固定石蜡包埋处理的样本（formalin-fixed and parrffin-embedded，FFPE）、新鲜组织、血液等]、送检医院科室及医师、送检日期和报告日期等；
病理信息：病理诊断、肿瘤细胞比例、特殊说明（出血、坏死、脱钙处理等）；
临床病史：可提供疾病史、治疗史、家族史等；
检测项目：所检测的基因目录、覆盖范围和变异类型、检测平台名称、分析软件版本号等（建议选择国家药品监督管理局批准认可的产品。
（2）标本质控信息：
标本病理评估：FFPE样本经苏木精-伊红染色后，评估样本所含肿瘤细胞比例，建议组织标本中肿瘤细胞比例达到30%以上，肿瘤细胞比例与基因突变检测率和检出的丰度值关系密切。
DNA质量评估：DNA的质量对检测结果的准确性有重要影响。需要从DNA纯度、DNA浓度以及DNA片段化程度进行充分评估。
文库制备及质量评估：测序前需要对DNA样本进行文库制备。基于扩增子的方法和基于杂交捕获的方法是目前常用的文库制备方法。选择合适的文库制备试剂盒，需考虑所使用样本的类型、DNA起始量、基因板数据量等因素。为使测序质量和产量达到最优，需要从DNA浓度及片段大小等方面对文库制备过程进行质控。
NGS测序质量评估：构建好的文库将在高通量测序仪上进行上机测序，测序完成后需要对原始数据进行质控，再进行后续的生物信息分析。
（3）检测结果证据等级：在文献综述基础上，建议将肿瘤体细胞基因变异根据证据等级分为4类：
Ⅰ类变异：明确临床意义的变异，A级证据是由FDA、国家药品监督管理局批准，或来自专业临床指南，B级证据是由临床研究证实，且取得领域专家共识；
Ⅱ类变异：潜在临床意义的变异，C级证据是由FDA、国家药品监督管理局批准的不同肿瘤类型的疗法或试验性疗法、多项小型已发表研究达成的共识，D级证据是临床前研究或少数病例报告，还未达成共识；
Ⅲ类变异：临床意义未明的变异，在一般或特定亚组数据库、泛癌种、肿瘤特异性变异数据库中未观察到显著的定位基因发生频率，还没有已发表的可信的与癌症相关的证据；
Ⅳ类变异：良性或可能良性变异，在一般或特定亚群数据库中观察到显著等位基因发生频率。目前尚无已发表的癌症相关性证据。
在NGS测序中，主要检测单核苷酸变异、插入缺失变异和基因融合等，参数调整后可分析基因拷贝数变异，根据相应变异结果，判读相应基因变异所表明的临床意义。
专家意见5：
临床医师在开展结直肠癌分子标志物检测时，应充分了解各检测方法的性能，推荐临床加强基因检测报告中样本类型、检测方法、突变类型等部分的关注和解读。推荐NGS在获得认证的平台和技术、严格的质控、规范的操作流程的基础上进行运用。
随着近年分子生物学在结直肠癌领域的研究不断深入，分子标志物在疾病诊断、指导治疗、预后分析等临床实践中起到了越来越重要的作用。加强对分子标志物机制、意义的认识，合理应用分子标志物在结直肠癌治疗中的指导作用，提高NGS等技术在结直肠癌分子标志物检测中的应用，是现阶段临床医生在临床实践中的必备技能，也是未来临床科研工作者的重要方向。
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