高渗盐水为何能治疗脑水肿？理解其非渗透性分子机制！
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脑水肿可能出现于多种颅脑疾病，如颅脑损伤、脑出血或缺血性卒中、蛛网膜下腔出血、脑肿瘤术后及颅内感染等，脑水肿加重可导致颅内压增高甚至发生脑疝危及生命。除针对病因治疗外，渗透性脱水也是一线治疗方案。常用脱水剂有甘露醇、高渗盐水(hypertonic saline，HS)、甘油果糖等，高渗盐水通过建立渗透梯度，将水分从细胞和细胞外间质吸入血管腔而起到组织脱水作用[1]。2022年最新版《高渗盐水治疗脑水肿及颅内高压的专家共识》针对多种临床情况给出高渗盐水规范的使用方法[2]。此外，多项基础和临床研究显示，高渗盐水除了因高渗透压导致的脱水作用外，还通过其他机制发挥作用，本文就高渗盐水治疗脑水肿的非渗透性分子机制进行综述，为高渗盐水的临床应用提供更广泛的理论依据。
一、下调水通道蛋白-4(Aquaporin 4，AQP4)
AQP4是哺乳动物脑组织中含量最高的水通道，主要表达于星形胶质细胞，调节渗透压驱动的被动水运输，已被证明与创伤性脑水肿的形成密切相关[3,4]。脑创伤后AQP4的表达增加，导致水肿和其他神经病理改变[5,6,7]。Rao等[8]证明液压冲击伤导致培养的星形胶质细胞AQP4的表达上调，并发现新合成是AQP4蛋白表达增加的主要机制。相反，AQP4基因敲除的小鼠在颅脑损伤后表现为更轻的脑水肿和更好的神经预后[9]。与此类似，Yao等[10]报道AQP4基因敲除可以明显减少脑缺血小鼠的脑水肿和脑梗死体积。Lu等[11]进一步研究AQP4产生的机制，结果表明，肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)通过激活核因子-κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)通路，促进转录因子p65与AQP4基因启动子区域的结合，增强了AQP4的表达，从而导致细胞水肿和细胞凋亡。另外，在其他多种病理条件下，AQP4也被广泛认为在脑水肿的形成中发挥着重要作用[12,13]。这些研究共同表明，AQP4是导致脑水肿的关键环节，抑制AQP4的表达有助于减轻脑水肿。
Yin等[14]发现3%HS减轻大鼠脑创伤后脑水肿可能与下调AQP4有关，进一步研究提示HS通过抑制脑损伤诱导的促炎细胞因子白细胞介素(interleukin，IL)-1β和TNF-α的表达、下调AQP4并减少细胞凋亡，从而减轻大鼠创伤性脑损伤后的脑水肿。Zhang等[15]也证明10%HS治疗可能通过减少星形胶质细胞的激活，降低炎症因子IL-1β和NF-κB的水平，下调损伤灶周围皮质组织中AQP4的表达，恢复血脑屏障的完整性，从而明显减轻颅脑损伤大鼠脑水肿程度。在缺血性脑卒中的研究中，Zeng等[16]的实验结果显示，10%HS除了建立渗透压梯度外，还可能通过下调血管周围星形胶质细胞AQP4的表达改善缺血周围脑组织的缺血性脑水肿；此外，HS的神经保护作用还可能与减少神经元凋亡有关。韩雪馨[17]在颅脑损伤患者的研究中发现，3%高渗盐水快速输注显著降低颅内压，并降低患者血清AQP-4及基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinases，MMP-9)水平，且未见对电解质及肾功能造成损害。这些研究共同说明，HS可通过降低炎症因子IL-1β、TNF-α和NF-κB的水平，从而下调AQP4的表达，最终减轻脑水肿。
二、下调离子通道蛋白
Na-K-Cl共转运系统(Na-K-Cl cotransporter，NKCC)由两种异构体组成——NKCC1(Na-K-Cl cotransporter 1，NKCC1)和Na-K-Cl共转运体2(Na-K-Cl cotransporter 2，NKCC2)，已被证明在离子稳态和细胞水肿中发挥重要作用[18,19]。研究结果显示，上调的离子转运体NKCC1导致钠、氯和其他溶质内流，最终导致细胞肿胀[20]。因此，NKCC1在缺血和创伤时星形胶质细胞肿胀及脑水肿中发挥重要作用[21,22]。Jayakumar等[23]采用体外气压创伤的流体冲击模型，证明在培养的星形胶质细胞受到创伤后，NKCC1的活性显著增加，并且NKCC1的激活导致星形胶质细胞的肿胀，肿胀程度与活性NKCC1水平呈正相关，表明NKCC1的激活是介导创伤后星形胶质细胞肿胀(细胞毒性脑水肿)的一个重要因素。Gong等[24]的研究补充NKCC1激活后的下游机制，在他们的手术脑损伤(surgical brain injury，SBI)模型中，NKCC1被激活，磷酸化下游的p-p65-NF-κB，并促进小胶质细胞分泌IL-1β、IL-6和TNF-α，导致神经炎症和血脑屏障破坏，最终导致脑水肿和神经功能损伤。另外，在缺血性损伤中，Chen等[25]发现抑制NKCC1活性可减少局灶性脑缺血后灰质和白质的缺血性损伤。这些结果一致说明，抑制NKCC1的表达可以减轻脑水肿。
Huang等[26]发现10%HS可通过下调NKCC1的表达减轻缺血性脑水肿；进一步研究显示，HS可通过抑制P38和c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)信号通路的激活，减少小胶质细胞释放TNF-α和IL-1β，从而下调大脑皮层星形胶质细胞NKCC1的表达，最终发挥减轻脑水肿作用。此外，实验还发现HS可能直接下调星形胶质细胞中NKCC1的表达导致脑水肿减轻。Jiang等[27]报道了一致的结论，他们通过动物实验联合临床试验证明，7.5%高渗盐水可以降低炎性细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，下调NKCC1、AQP4的表达，从而降低脑组织水肿和颅内压，促进脑组织保护。与此类似，在大鼠重症急性胰腺炎动物模型中，高渗盐水干预使促炎细胞因子TNF-α和IL-6生成减少，增加抗炎细胞因子IL-10释放，使得胰腺损伤减轻[28]。蒋真真[29]的临床实验发现，7.5%高渗盐水显著降低创伤性脑损伤患者的颅内压，且随着给药天数增加，患者血清中AQP4、NKCC1及炎性因子IL-1β、TNF-α和IL-6也逐渐下降，而血清电解质、尿素氮和肌酐未受影响；同时研究还显示，相较于缓慢给药及先快后慢给药速度，快速给药降低颅内压的效果更好。综上所述，HS可通过抑制P38和JNK信号通路，从而降低炎性因子TNF-α、IL-1β、IL-6的水平，进而下调NKCC1的表达，最终减轻脑水肿。
三、保护血脑屏障
颅脑损伤引起的脑水肿涉及一个高度复杂的机制，其中血脑屏障完整性的破坏是导致血管源性脑水肿和继发性损伤的主要原因[30]。血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被证明具有神经保护作用，并促进创伤后神经、血管再生，而另一方面，研究结果显示VEGF还可以通过增加血脑屏障的通透性导致脑水肿加重[31,32,33,34,35,36]。已有研究表明，VEGF可通过下调紧密连接蛋白闭锁小带-1(zonula occludens-1，ZO-1)和Claudin-5的表达，从而导致血脑屏障的破坏[37]。因此可以推测，抑制VEGF的表达及其下游通路的激活可能通过保护血脑屏障来减轻脑水肿。
Huang等[38]发现10%HS可以减轻缺血性脑水肿，并发现这种作用可能是通过降低血脑屏障通透性和保护血脑屏障完整性实现；进一步研究显示，HS可通过抑制星形胶质细胞VEGF及其受体血管内皮生长因子受体2(vascular endothelial growth factor receptor 2，VEGFR2)的表达而下调血脑屏障通透性；最后，他们探究了HS抑制VEGF/VEGFR2的表达下调血脑屏障通透性的原因，结果显示，HS显著抑制紧密连接蛋白ZO-1和claudin-5的下调。因此，HS减轻脑水肿的机制可能是通过抑制VEGF介导的ZO-1和claudin-5的下调来保护血脑屏障的完整性实现的。随后，Wang等[39]继续探讨HS调节ZO-1和occludin表达的可能机制，结果显示，10%HS可通过抑制血管内皮生长因子受体2/磷脂酶Cγ1/内皮型一氧化氮合酶(vascular endothelial growth factor receptor 2/phospholipase Cγ1/endothelial nitric oxide synthase，VEGFR2/PLCγ1/eNOS)信号通路介导的ZO-1和occludin的下调而减轻缺血诱导的血脑屏障通透性增加，从而减轻脑水肿。此外，Wang等[40]最近还研究VEGF的上游机制，他们发现10%HS可以通过抑制小胶质细胞中NACHT，LRR和PYD结构域包含蛋白3(NACHT，LRR，and PYD domains-containing protein 3，NLRP3)炎性小体的激活来减少IL-1β的释放，进而通过抑制星形胶质细胞中IL-1β/IL-1R1/NF-кB信号通路的活性来下调星形胶质细胞来源的VEGF的表达，最终降低缺血性卒中引起的血脑屏障通透性增大，减轻缺血性脑水肿。
综上所述，HS先通过抑制小胶质细胞中NLRP3炎性小体的激活来减少炎性因子IL-1β的释放，进而通过抑制星形胶质细胞中IL-1β/IL-1R1/NF-кB信号通路来下调VEGF的表达，然后通过抑制VEGFR2/PLCγ1/eNOS介导的ZO-1和occludin的下调来保护血脑屏障的完整性，这可能是HS治疗脑水肿的机制之一。
四、调节小胶质细胞向M2抗炎表型极化
小胶质细胞是驻留在中枢神经系统(central nervous system，CNS)的巨噬细胞样免疫细胞，对维持中枢神经系统的内稳态和正常功能具有重要作用。已有研究表明，小胶质细胞通过形成典型的M1样或M2样表型参与急性脑损伤的反应。M1型小胶质细胞介导产生细胞因子、趋化因子、活性氧化物(reactive oxygen species，ROS)和其他免疫调节分子，继而增加脑组织的炎性损伤。相反，M2小胶质细胞在神经疾病中产生抗炎因子并上调神经保护因子，因而被认为是神经修复细胞[41,42]。在创伤性颅脑损伤(traumatic brain injury，TBI)和缺血性卒中模型中，均观察到随着时间的推移M2向M1的动态变化，M1小胶质细胞/巨噬细胞在损伤区域逐渐占据主导地位，并通过加剧炎症反应进而加重继发性脑损伤[43,44]。在蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)的研究中报道了早期以M1小胶质/巨噬细胞为主，随后过渡到M2表型[45]；抑制小胶质细胞M1的极化和促进M1表型向M2表型的转变显著减弱了SAH后的神经炎症并改善神经预后[46,47]。这些研究提示，抑制小胶质细胞M1极化，介导其向M2抗炎表型极化，可能有助于减轻脑水肿。
Wen等[48]报道在大鼠大脑中动脉闭塞(middle carotid artery occlusion，MCAO)模型中，10%HS减少脑梗死面积和缺血性脑水肿；进一步研究显示，这可能是通过HS抑制小胶质细胞M1极化并介导其向M2极化起作用的。随后，他们从微小RNA(microRNA，miRNA，miR)角度深入研究HS调节小胶质细胞极化的可能机制，结果显示，HS通过减少miR-200b和诱导下游的转录因子Krüppel-样因子4(Krüppel-like factor 4，KLF4)来抑制小胶质细胞M1极化，介导其M2极化，从而减轻神经炎症并促进神经营养因子分泌，进而有助于减轻脑水肿。此项研究第一次证明HS在脑水肿治疗中可能通过miR-200b/KLF4轴调节小胶质细胞极化。同样，在脑出血的研究中，Schreibman等[49]发现23.4%HS降低了脑水肿和死亡率，这可能与HS减弱血肿周围及健侧脑组织中小胶质细胞M1样表型，促进M2样表型有关。此外，研究还证明HS的应用减少了分化簇45阳性(cluster of differentiation 45-positive，CD45＋)白细胞(外周免疫细胞)的渗透，这可能是HS改善脑水肿的又一机制。然而遗憾的是，实验没有探究影响小胶质细胞极化的分子机制。因此，未来需要更多的研究阐明HS在不同颅脑疾病中调节小胶质细胞极化的分子机制。
五、减轻星形胶质细胞肥大
星形胶质细胞是中枢神经系统中含量最丰富的一种胶质细胞，它们为神经元提供代谢物和生长因子，支持突触形成和可塑性，调节细胞外离子、液体和神经递质的平衡，并参与血脑屏障(blood-brain barrier，BBB)的构成和调节通透性[50,51,52]。另外，星形胶质细胞还是免疫活性细胞，通过分泌细胞因子和趋化因子参与免疫炎性反应[53]。已有文献表明，星形胶质细胞的激活主要表现为胞体肥大，突起明显增厚[54]。例如，机械创伤会导致培养的星形胶质细胞肿胀[55]。此外，研究也表明，星形胶质细胞的激活介导了颅脑损伤和缺血性卒中后的炎症反应，抑制星形胶质细胞的激活可通过减少中枢神经系统的炎症反应来减轻继发性损伤[56,57,58,59]。根据上述研究可以推测，抑制星形胶质细胞的激活可能通过减少炎症反应导致脑水肿减轻。
Elliott等[60]发现创伤性脑损伤后高渗盐水治疗减少了损伤周围组织的液化性坏死，进一步研究表明，这可能是通过减轻星形胶质细胞肥大，降低其免疫反应性获得的神经保护作用。另外，研究还发现伤后1 h延迟给药较伤后10 min的即刻给药益处更大，这可能与继发性损伤的发生机制受时间依赖性的影响有关，提示创伤性脑损伤的渗透脱水治疗存在一个治疗窗口。最近的研究表明，反应性星形胶质细胞存在两种不同的极化状态——神经毒性A1型和神经保护性A2型[61]。A1型星形胶质细胞由激活的小胶质细胞分泌的IL-1α、TNF-α和C1q诱导，直接释放神经毒性补体C3d，导致神经元死亡；抑制A1型星形胶质细胞的激活可产生显著的神经保护作用[62,63]。相反，A2型星形胶质细胞被认为具有保护作用，通过分泌许多抗炎和神经营养因子并促进神经元再生，在中枢神经系统中发挥有利作用[64,65]。这些研究提示高渗盐水对不同类型反应性星形胶质细胞的影响有待进一步阐明。
六、减少中性粒细胞的炎性浸润
研究结果显示，中性粒细胞(又称多形核白细胞，polymorphonuclear cell，PMN)可通过释放基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)、ROS和TNF-α导致细胞分解和细胞毒性水肿[66]。在Kenne等[67]的研究中，相较于对照组小鼠，通过腹腔注射抗体导致中性粒细胞耗竭的小鼠在脑创伤后的水肿更轻，且损伤体积更小。另外，研究还发现中性粒细胞去除也导致小胶质细胞的激活减少。此外，Pascual等[68]的研究也表明，抑制体内中性粒细胞的激活显著减少PMN的滚动和与血脑屏障内皮细胞的黏附，进而降低微血管通透性，对创伤性脑损伤具有神经保护作用。上述研究表明，抑制中性粒细胞的激活和炎性浸润可能有助于减轻脑水肿。
Soustiel等[69]的研究显示，HS减轻了脑外伤后的继发性损伤，促进了细胞的存活；具体而言，高渗盐水的应用显著减少中性粒细胞的炎性浸润，显著减轻钙蛋白酶介导的细胞骨架损伤，并能够明显减少细胞凋亡。一项临床研究也发现，院前高渗盐水治疗抑制了重型颅脑损伤患者中性粒细胞的过度激活[70]。多项研究证实，在脊髓和周围器官中HS可抑制PMN和内皮细胞(endothelial cells，EC)的激活，并减轻全身微血管床休克复苏后的组织水肿[71,72,73,74]。然而，有趣的是，在Marks等[75]的颅脑损伤实验研究中，HS并未引起PMN滚动或黏附的显著差异，对模拟脑损伤后PMN-EC的相互作用无明显影响；推测原因可能为HS对中性粒细胞介导的炎症的钝化作用在脑组织中不存在，提示还需要进一步的研究来确定高渗盐水渗透疗法是否对损伤后血脑屏障PMN-EC的相互作用有更微妙的影响，从而发挥潜在的临床优势。
七、减轻氧化应激损伤
大量研究表明，在颅脑损伤的病理生理学中，氧化应激参与了脑水肿、炎症和继发性神经元损伤的发展，因而被认为是继发性损伤的关键因素[76,77]。颅脑损伤引起的ROS的过量产生参与了脑损伤后细胞凋亡的启动[78]。而脑外伤后的抗氧化应激治疗则可以减轻脑水肿、减少细胞凋亡并改善行为功能障碍[79,80]。这些研究一致表明，抑制氧化应激可能有助于减轻脑水肿。
Yilmaz等[1]研究HS对脑创伤大鼠细胞损伤的预防作用，实验结果表明，7.5%HS通过减少丙二醛(malondiadehyde，MDA)的形成减轻了细胞损伤，丙二醛的水平被认为是细胞水平的氧化损伤指标。此外，他们还研究了HS对抗氧化酶的影响，结果显示，HS增加了过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的使用，这两种抗氧化酶的消耗可能是导致丙二醛产生减少的原因。之后，Ates等[81]报道了脑室注射高渗盐水对脑外伤大鼠水肿性脑组织氧化损伤的影响，主要包括下面几种保护途径：3%HS通过升高谷胱甘肽(glutathione，GSH)水平保护脑组织免受创伤后增加的氧化或亚硝酸盐负荷的影响，通过下降丙二醛水平减轻创伤后脑组织脂质过氧化损伤，通过降低一氧化氮(nitric oxide，NO)水平保护脑组织免受氧化应激的影响，并通过抑制炎性因子IL-1β的释放发挥神经保护作用。Mojtahedzadeh等[82]在一项关于成人颅脑损伤的研究中发现，5%高渗盐水治疗可以显著降低患者血清ROS及一氧化氮水平。此外，张涛和郭旗[83]使用托拉塞米联合3%高渗盐水治疗重症颅脑外伤患者，结果显示，联合给药能够显著提高患者血清超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)及总抗氧化能力(total antioxidant capacity，T-AOC)水平，降低丙二醛水平，表明联合干预能够减轻机体氧化应激水平。铁死亡是一种新发现的调节性细胞死亡形式，其特征是铁介导的脂质过氧化物的积累，抑制铁死亡可以减轻小鼠创伤性脑损伤后的组织损伤并改善其长期预后[84,85]。然而，目前尚缺乏文献证实HS对脑损伤后细胞铁死亡的影响，提示未来需更多研究证明HS对铁死亡的影响是否存在。
八、改善凝血纤溶平衡
凝血功能障碍是颅脑损伤患者的常见并发症，既可以表现为血液高凝，也可以是纤溶亢进，是一个强大的、独立的预后预测因子[86,87]。一项临床研究显示，脑挫裂伤患者凝血功能异常是导致迟发性颅内血肿的危险因素[88]。脑外伤患者凝血系统功能障碍主要是由脑组织中的组织因子暴露所致，脑损伤后大量组织因子的暴露使得机体的凝血、纤溶和抗凝途径异常激活[89]。内皮细胞被细胞因子激活或损伤后，通过合成促凝剂组织因子(tissue factor，TF)和抗凝剂血栓调节蛋白(thrombomodulin，TM)参与出凝血平衡[90]。此外，由内皮细胞和单核细胞分泌的TNF-α是一种强TF诱导剂，并抑制细胞膜表面TM的表达，从而使凝血平衡转向血管内血栓形成和纤溶亢进，同时释放纤维蛋白降解产物D-二聚体[91,92]。
Coleman等[93]研究了高渗盐水降颅压对凝血功能的影响，使用临床标准剂量的23.4%HS团注给药治疗脑损伤大鼠模型，对止血能力没有显著不良影响，提示HS治疗颅内高压在凝血方面是安全的。Wang等[94]进行的一项临床研究也显示使用3%HS控制颅内压对患者凝血功能无明显影响。此外，一项临床研究报道了HS可以减少脑损伤后TF和D-二聚体的表达，并维持血栓调节蛋白的正常表达水平，提示高渗盐水复苏有助于改善脑外伤后凝血纤溶平衡[95]。Yang等[96]进一步研究了高渗盐水在治疗中重度颅脑损伤患者时维持凝血纤溶平衡的机制，结果显示7.5%HS处理可抑制外周血单核细胞中长非编码RNA2448-11(long noncoding RNA2448-11，lncRNA2448-11)、长非编码RNA1403(long noncoding RNA1403，lncRNA1403)及相关基因的表达，从而降低CD14＋＋ CD16＋炎性单核细胞比例，抑制TNF-α和IL-1β的表达，降低血栓调节蛋白表达水平，促进转化生长因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)的表达，改善凝血纤溶平衡，并能降低颅内压，升高患者的脑灌注压，最终减少对脑的继发性损伤。
高渗盐水在脑水肿的治疗中，除了由高渗透压导致的脱水外，还具有额外的有益效应。本文总结了高渗盐水治疗脑水肿的非渗透性分子机制，主要包括下调水和离子通道蛋白，保护血脑屏障完整性，调节炎性细胞如小胶质细胞、星形胶质细胞和中性粒细胞的激活与浸润，减轻氧化应激损伤，以及改善凝血纤溶平衡。
水和离子通道蛋白是脑水肿产生的基础环节，高渗盐水对AQP4和NKCC1的调节在减轻脑水肿上起到协同作用；从内在机制来看，HS均是通过降低IL-1β、TNF-α等炎症因子的水平从而下调AQP4和NKCC1的表达。同时，HS也是通过抑制IL-1β/IL-1R1/NF-кB炎性信号通路来下调VEGF的表达，从而保护血脑屏障完整性。如前所述，HS在减轻氧化应激损伤的同时，可以通过抑制炎性因子IL-1β的释放发挥神经保护作用。此外，HS改善凝血纤溶平衡的机制也包括降低炎性细胞比例，抑制炎性因子TNF-α和IL-1β的表达。因此，可以看出，对炎性因子的抑制是HS在多方面发挥作用减轻脑水肿的共同内在机制。而作为炎性反应的主体，小胶质细胞、星形胶质细胞及中性粒细胞通过产生细胞因子和炎性介质参与继发性脑损伤中的病理生理过程，HS对上述炎性细胞的调节显示出在细胞层面对神经炎症的宏观影响。
综上所述，继发性脑损伤的各种病理生理机制不是独立起作用，而是相互联系，构成复杂的调节网络导致最终的临床结果，因而高渗盐水的治疗机制也是在复杂网络的多点位发挥影响，改善最终的治疗结局。
引用: 孙和勇, 张刚利. 高渗盐水治疗脑水肿的非渗透性分子机制 [J] . 中华实验外科杂志, 2023, 40(12) : 2690-2696.