西南大学代方银教授研究团队：三元试剂制备的再生丝素蛋白与溴化锂制备的再生丝素蛋白生物相容性差异 | MDPI Polymers

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文章导读

家蚕的丝素蛋白 (Silk Fibroin, SF) 因优良的生物相容性和力学性能在生物材料领域得到了广泛的应用，但很多情况下 SF 不能直接应用，需要先进行溶解并再生。溴化锂 (LiBr) 是一种常用的溶解 SF 的溶剂。然而，LiBr 因其价格昂贵、有较强的生物毒性和环境毒性，不适用于再生丝素蛋白 (Regenerated Silk Fibroin, RSF) 的规模化生产。

在此背景下，西南大学代方银教授研究团队在 Polymers 期刊发表的文章，系统评价了将价格低廉、环境毒性小的三元试剂 (CaCl₂-EtOH-H₂O) 体系作为替代方案的可行性。结果证实，利用三元试剂制备的 RSF 的形态和氨基酸组成与使用 LiBr 溶剂制备的相同，尽管利用三元试剂制备的 RSF 在长时间透析后仍会残留少量钙，但残留的钙并不会引起 RSF 结构及性能的明显改变，包括细胞毒性、血液相容性和抗菌性能等生物学性能。因此，三元试剂是规模化制备再生丝素蛋白的理想方案。

研究过程与结果

作者通过控制 SF 溶解条件，利用 9 mol LiBr 和三元试剂制备出分子量相同的两种 RSF，以避免分子量对测试结果的干扰。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳 (Sodium Dodecyl Sulfate–polyacrylamide Gel Electrophoresis, SDS-PAGE) 测试结果表明，LiBr 溶解制备的 RSF-Li 和三元试剂制备的 RSF-Ca 的能带分布几乎相同，说明他们分子量相同，可用于后续实验 (图 1、2)。作者利用原子力显微镜 (Atomic Force Microscope, AFM) 和透射电镜 (Transmission Electron Microscopy, TEM) 观察到，两种 SF 在溶液态的形貌基本相同，呈椭球形。

图 1. RSF 的分子量和形态。

图 2. RSF 的氨基酸组成情况。

作者采用电感耦合等离子体原子发射光谱法 (Inductively Coupled Plasma-atomic Emission Spectroscopy, ICP-AES) 测定了 Ca、Li 含量，结果如图 3 所示。RSF-Ca 的 Ca 含量约为天然 SF 的 6 倍，表明三元试剂制备的 RSF 经过三天透析仍有少量 Ca 保留在 RSF 中。延长透析时间至 7 天，RSF-Li 中不会检测到 Li，而 RSF-Ca 中仍会有少量 Ca。表明 Ca 更容易与 SF 结合。

图 3. RSF 中的元素含量。

两种 RSF 样品的抑菌活性结果如图 4 所示。由图 4a 可知，RSF 对大肠杆菌有明显的抑制作用，且两种 RSF 样品均表现出相同的抗菌活性。12h 后，治疗组大肠杆菌存活率仅为对照组的 75%。然而，两种 RSF 样品都没有抑制金黄色葡萄球菌的生长。以上结果表明，两种溶剂对 RSF 的抗菌性能没有显著影响。

图 4. RSF-Li 和 RSF-Ca 的抗菌性能示意图。

作者将两种 RSF 样品添加到细胞培养基中来观察不同样品是否会对细胞生长带来不同的影响 (图 5)。在培养的第一天，L929 细胞在含有 RSF 的培养基中和对照组中均生长良好，细胞形态与对照组相似；到了第三天，细胞数量有了明显增加，并且轮廓清晰，细胞形态由梭形转变为圆形；第五天细胞开始死亡。在不同培养基中培养的细胞在细胞大小、形状和轮廓方面没有显著差异。不同浓度的 RSF 溶液与家兔血红细胞直接接触，溶血性也没显著差异。

图 5. RSF 的细胞相容性和溶血作用。

作者将 2% 的 RSF 溶液在相同条件下浇筑成薄膜，并对其结构进行测试 (图 6)。FTIR、XRD 和 DSC 结果均显示，RSF-Ca 具有较多的 β-sheet，因此也表现出较高的热稳定性，但与 RSF-Li 相比并不显著。由于 Ca²⁺ 可促进 SF 分子向 β-sheet 转变，因此，作者推测 RSF-Ca 中残留的 Ca 导致了这个结果。

 6. RSF 薄膜的结构分析。

作者将两种 RSF 膜与兔血小板的粘附性进行了测试 (图 7)。实验结果表明，血小板与 RSF 膜的粘附性在静态条件下更强。对单位膜面积上粘附的血小板数量进行统计分析，发现 RSF-Ca 膜上的血小板数量高于 RSF-Li 膜上的血小板数量，但差异不显著。

图 7. 两种 RSF 样品的血小板粘附情况。

研究总结

◆ 微量 Ca 残留在三元溶剂溶解的 RSF 中，即使经过长时间透析也很难完全去除。这可能会导致材料结构和性能的些微变化。

◆ 本研究结果表明，三元试剂制备的 RSF 在氨基酸组成、形态、抑菌活性、细胞毒性、膜结构和性能方面与使用 LiBr 制备的 RSF 无显著差异。因此，可以认为三元试剂是溶解 SF 的理想替代溶剂。

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原文出自 Polymers 期刊

Cheng, G.; Wang, X.; Wu, M.; Wu, S.; Cheng, L.; Zhang, X.; Dai, F. Insignificant Difference in Biocompatibility of Regenerated Silk Fibroin Prepared with Ternary Reagent Compared with Regenerated Silk Fibroin Prepared with Lithium Bromide. Polymers 2022, 14, 3903.

    Polymers 期刊介绍

主编：Alexander Böker, University of Potsdam, Germany

期刊主题涉及聚合物化学、聚合物分析与表征、高分子物理与理论、聚合物加工、聚合物应用、生物大分子、生物基和生物可降解聚合物、循环和绿色聚合物科学、聚合物胶体、聚合物膜和聚合物复合材料等研究领域。

2021 Impact Factor	4.967
2021 CiteScore	5.7
Time to First Decision	13 Days
Time to Publication	31 Days

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