湖南大学谭蔚泓/邱丽萍JACS：DNA纳米平台用于编程细胞相互作用
第一作者：Jin Li
通讯作者：谭蔚泓、邱丽萍
通讯单位：湖南大学
研究亮点：
1. 通过自组装构建的两亲性四面体DNA探针，可以快速高效且有方向地插到细胞膜上，且可避免细胞内化。
2. 通过调节疏水性顶点数来微调膜锚定亲和力，带有三个疏水顶点的DNA四面体可稳定地锚定在膜上。
3. 利用该纳米平台，实现了对细胞间进行特异性粘附，有效和可调节的控制，可用于进行细胞生物学方面的研究。
研究背景：
细胞间的相互作用，即细胞表面之间的直接相互作用，对于单个细胞和多细胞生物的命运和功能至关重要。相互作用特异性或相互作用强度的破坏都可能导致生物学功能障碍，甚至导致疾病进展，例如代谢异常，自身免疫性疾病和癌症。
为了赋予细胞在相互作用时具有特定的调节作用，许多不同的功能材料，包括蛋白质，核酸，纳米颗粒和聚合物，都曾在细胞表面进行过工程改造。其中，核酸具有易于合成、可预测的结构和高度可编程性的优势，为精确控制相互作用强度和特异性提供了极好的材料。
针对核酸能在细胞表面上插入，已经开发了几种策略，包括化学反应，代谢标记，脂质体融合和疏水性插入。尽管用膜修饰的DNA探针实现了特定的多细胞组装，但仍有很大的改进空间。在对原始细胞状态影响最小的情况下便捷地进行是细胞表面工程的主要的要求。由于细胞膜组合物的高度动态性质和复杂的细胞培养环境，维持DNA探针的表面呈递仍具有挑战性。而另一个挑战是表面固定探针由于方向性差而导致靶向能力受到限制。
成果简介：
有鉴于此，湖南大学邱丽萍副教授联合谭蔚泓院士团队通过使用DNA自组装技术开发了一系列用于细胞表面工程的两亲性金字塔形（四面体）DNA探针，旨在构建一个有效，稳定，生物相容且通用的平台来专门调节细胞相互作用。这些两亲性四面体通过四个DNA寡核苷酸自组装，在一个顶点带有一个悬垂的DNA探针，而在另一个顶点带有胆固醇标签。通过胆固醇与细胞磷脂层之间的疏水相互作用有效地锚定在细胞膜上。结合优异的靶标识别能力和高度多样性的悬垂DNA探针有望为研究和操纵细胞间反应提供一种有效且可设计的纳米平台。
图1. 两亲性DNA探针控制细胞接触示意图
要点1：金字塔形DNA探针的构建和表征
研究人员通过逐步添加从S1到S4的寡核苷酸来构建DNA四面体纳米结构。通过凝胶迁移和AFM结果表明，约10nm大小的DNA四面体纳米结构被成功构建，且该结构的形成不受胆固醇标记的影响。
接下来，研究人员继续评估了两亲性DNA纳米结构在细胞表面工程中的可行性（以T-cho3为例）。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察到了荧光素（FAM）荧光与膜染色染料DiI荧光很好地共定位，从而验证了T-cho3成功地修饰在膜上。此外，通过流式细胞仪实验，观察到了T-cho3可快速高效进行膜锚定，且筛选出250 nM的探针浓度和10分钟的孵育时间作为后续实验。
图2. 金字塔形DNA探针的构建和表征
要点2：两亲金字塔形DNA探针对细胞表面修饰的能力
紧接着，研究人员对不同DNA探针的膜锚定能力进行测试。CLSM结果表明，随着疏水性顶点数量的增加，DNA四面体的膜锚定效率明显提高。然而，与结合有一个胆固醇标签的线性DNA探针（S-cho1）相比，可能是由于四面体结构的位阻增加和电荷排斥导致T-cho1的膜锚定效率降低。而具有三个疏水性顶点，T-cho3表现出最强的膜锚定稳定性且可以有效减少其细胞内在化。总体而言，这些结果表明，T-cho3构建体为细胞表面工程提供了有效而可靠的平台。
图3. 两亲金字塔形DNA探针对细胞表面修饰的能力
要点3. 通过DNA杂交精确控制细胞间的接触
研究人员继续测试T-cho3操纵细胞间粘附的潜力。分别用具有悬垂DNA探针1和2的两个不同的T-cho3修饰两群不同细胞。在添加DNA连接体L1-2后，可观擦到明显的细胞组装，且效率高达88%。同时，通过添加L1-2的完全互补DNA（cL1-2），可以容易地逆转细胞聚集体。另外，通过比较连接体长度对细胞聚集的影响，发现长的连接体越能聚集高团簇细胞。总的来说，受益于DNA分子的高度可编程性，这种外膜锚定的纳米平台显示出极好的调节细胞间粘附的能力。
图4. 载药脂肪细胞抑制肿瘤生
要点4. 基于适配体的分子识别对细胞间的精确控制
除DNA杂交外，适配体的分子识别也可实现具有靶向功能的细胞间粘附。研究人员合成了四个两亲性适配体探针。将sgc8功能化的细胞与未修饰的CEM细胞分别以1:10的比例混合。实验结果表明T-cho2和T-cho3具有更高的膜锚定亲和力，能够实现更有效和永久的细胞结合。综上所述，这种3D四面体支架可使识别探针具有较强的膜锚定稳定性和更高的靶标识别能力，从而为操纵细胞间粘附提供了强大的纳米平台。
图5. 适配体的分子识别对细胞间的精确控制
要点5. 细胞间接触触发的细胞内信号反应
在许多情况下，细胞之间的直接物理接触是触发有效的细胞间传导的关键初始步骤。为了测试膜锚定DNA纳米平台具有增强细胞间通讯的潜能，研究人员使用Raji B和A549两个细胞系进行实验。基于T-cho3介导的DNA杂交，可以将这两种细胞系特异性组装在一起。结果发现表明，使用当前的纳米平台操纵细胞之间的物理接触可以调节细胞的通讯行为。而且，该平台能构建特定模式的多细胞组装，这为研究体外多细胞信号网络提供有用的策略。
图6. 细胞间接触触发的细胞内信号反应
小结：
综上所述，这种3D两亲性DNA构建体为细胞表面工程提供了有效而可靠的纳米平台，通过使用这种纳米平台，实现了对细胞间粘附的特异性、有效和可调节的控制。此外，由于DNA分子的高度可编程性和高度多样性，该纳米平台可用于研究细胞生物学的各种膜锚定操纵器/生物传感器。
参考文献：
Li, J.; Xun, K.; Pei, K.; Liu, X.; Peng, X.; Du, Y.; Qiu, L.; Tan, W., Cell-Membrane-Anchored DNA Nanoplatform for Programming Cellular Interactions. Journal of the American Chemical Society 2019.
https://doi.org/10.1021/jacs.9b04725
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