阎锡蕴院士等Nano Lett.：Fenozyme在脑疟疾治疗取得新进展！
第一作者：赵帅
通讯作者：阎锡蕴、范克龙
通讯单位：中科院生物物理研究所
研究亮点：
1. 利用Fenozyme的类过氧化氢酶的特性，清除活性氧并保护BBB免受损伤
2. 发现HFn和Fenozyme都能刺激巨噬细胞向M1型极化并增强对pRBC的吞噬作用
3. 利用Fenozyme可有效缓解在蒿甲醚治疗导致的认知障碍
研究背景：
疟疾现状
疟疾是由原生动物疟原虫引起的蚊媒传染病，全世界每年有2亿多例，且有40万人死亡。在感染人类的5种疟原虫中，恶性疟原虫经常引起严重症状，包括威胁生命的神经系统并发症，脑疟疾。尽管抗疟药和基于青蒿素的联合疗法的开发取得了重大进展，但脑疟疾的死亡率仍高达30％，尤其是在儿童中。此外，10-24％患脑疟疾的儿童患者表现出神经系统后遗症和记忆力减退，这突显出寻找更有效和具体治疗方法的重要性。
脑型疟疾的发病机理
为了了解脑型疟疾的发病机理，科学家们已经做出了巨大的努力。脑中感染的红细胞在脑中累积是导致脑疟疾的原因。这些受感染的细胞表达恶性疟原虫红细胞膜蛋白1（PfEMP1），并且可以与内皮细胞膜蛋白结合。使用实验性脑疟疾小鼠模型进行的研究已经证明微血管内皮细胞的损伤和血脑屏障（BBB）的破坏在脑病的发展中起着至关重要的作用。并且还有实验已经表明从破裂的寄生虫感染的红细胞释放的游离血红素可能会产生过量的活性氧（ROS），从而损害内皮细胞并损害BBB。因此，ROS可能是在脑疟疾发展过程中损害血脑屏障的重要介质。
铁蛋白的应用
先前研究发现，人铁蛋白（HFn）可以与BBB 内皮细胞（BBB ECs）上表达的HFn受体（HFRs）结合，并作为多功能纳米载体用于疾病治疗。且含Fe3O4的纳米颗粒的纳米酶具有类过氧化氢酶的活性，能有效地抑制体内ROS水平。
成果简介：
有鉴于此，中科院生物物理研究所阎锡蕴院士和范克龙研究员团队利用HFn蛋白为壳和Fe3O4纳米酶为核组成的Fenozyme。当对患有实验性脑疟疾的小鼠给药时，通过保护BBB ECs免受ROS损伤并通过使巨噬细胞极化至M1表型来降低寄生虫血症，Fenozyme大大提高了存活率。此外，将Fenozyme和抗疟疾蒿甲醚联合使用可减轻脑病和记忆障碍。结果证明了ROS在脑部疟疾发展中的重要性，并表明将Fenozyme与抗疟药相结合是一种新颖的治疗策略。
图1. Fenozyme体内作用示意图
要点1：Fenozyme保护小鼠免受实验性脑疟疾
研究人员通过仿生合成了H-铁蛋白纳米笼包含Fe3O4核结构的人工酶（Fenozyme）。除了具有完整结构且稳定性良好外，Fenozyme还表现出过氧化氢酶或过氧化物酶活性。然后，研究人员评估了Fenozyme对伯氏疟原虫ANKA寄生的红细胞（pRBCs）的小鼠模型的影响。结果发现，经Fenozyme处理的小鼠中在第16天只有20％死亡，且可显着提高在感染后幸存的小鼠的活动（扶正和抓地力）评分。
已知患有ECM的小鼠的死亡和异常活动是BBB破坏的结果。研究人员利用了伊文思蓝检查BBB的完整性。结果表明，用Fenozyme处理感染的小鼠后，脑部染色明显降低，几乎与未感染的小鼠相同。因此，Fenozymes保护BBB免受ECM诱导的损害，并且其酶活性是该保护作用所必需的。
图2. Fenozyme保护小鼠免受实验性脑疟疾
要点2：Fenozyme通过清除ROS保护大脑内皮细胞
先前研究发现，HFn可以通过与HFRs结合而与BBB的内皮细胞相互作用。为了解Fenozyme保护BBB的机制， 研究人员对小鼠脑进行石蜡切片。结果表明，HFn壳可以结合HFR，并将Fenozyme定向到小鼠大脑中BBB的内皮细胞上。同时，研究人员通过荧光共定位和添加H2O2模拟氧化应激环境表明，Fenozyme通过HFRs内吞途径进入胞质，起过氧化氢酶作用，且能够利用类过氧化氢酶活性来保护内皮细胞免受ROS损伤。另外，Fenozyme通过清除ROS能保护BBB的完整性。
图3. Fenozyme通过清除ROS保护大脑内皮细胞
要点3. Fenozyme通过增强巨噬细胞的增殖和吞噬作用来降低寄生虫血病
为了充分了解Fenozyme对ECM小鼠的影响，研究人员检查了其血液中Pb.ANKA的水平。小鼠感染pRBC后4天检测到寄生虫血病。而使用Fenozyme或HFn蛋白可减少寄生虫感染的红细胞。这可能是由于HFn作用于红细胞而抑制或杀死寄生虫所致，又可能是作用于吞噬细胞而消除pRBC。
研究人员进一步研究HFn和Fenozyme对巨噬细胞的影响。肝脏中的巨噬细胞主要负责清除应激性红细胞和回收铁。通过实验发现，经Fenozyme和HFn处理的ECM小鼠的肝脏中巨噬细胞数量显著增加，这表明肝脏中的巨噬细胞在减少寄生虫病中起了主要作用。而且通过评估巨噬细胞对pRBC的吞噬能力发现，Fenozyme可能通过增强巨噬细胞的增殖和吞噬作用来降低ECM小鼠的寄生虫血症。
图4. Fenozyme通过增强巨噬细胞的增殖和吞噬作用来降低ECM小鼠的寄生虫血症
要点4. Fenozyme诱导巨噬细胞向M1极化
巨噬细胞可分化为具有促炎和杀微生物活性的M1亚型，或具有抗炎和促肿瘤作用的M2亚型。为了了解Fenozyme是否会影响巨噬细胞分化，研究人员对Raw264.7细胞和PKC细胞在用Fenozyme和HFn处理后，都增加了M1相关信号的激活。因此，Fenozyme可以通过HFRs诱导初级和转化的巨噬细胞向M1极化。
图5. Fenozyme诱导巨噬细胞向M1极化
要点5. Fenozyme减轻脑炎和认知障碍
在以青蒿素为基础治疗后的幸存的脑疟疾患者通常表现出永久性认知障碍。而这些损伤是由血脑屏障破坏、脑部炎症和神经元损伤引起的。因此，研究人员通过检测脑中白细胞浸润的程度，来检查Fenozyme是否对青蒿素（ARM）处理的ECM小鼠的BBB功能受损发挥了保护作用。实验发现蒿甲醚联合Fenozyme治疗的ECM小鼠的脑部浸润的CD45+细胞明显减少。
而且还评了小鼠的新的客观识别以及主动和被动回避能力。加入Fenozyme治疗组可保护小鼠免受ECM诱导的记忆力损害且具有主动回避能力。综上所述，这些结果表明，Fenozyme对BBB的保护不仅减少了因脑疟疾引起的小鼠死亡，而且减轻了感染小鼠认知功能的损害。
图6. Fenozyme减轻脑炎和蒿甲醚治疗ECM小鼠的认知障碍。
小结：
综上所述，Fenozyme通过与BBB内皮细胞相互作用并清除活性氧而显着降低了ECM小鼠的死亡率，且可有效缓解在蒿甲醚治疗后幸存的ECM小鼠的神经系统后遗症，表明将其与蒿甲醚联用可能是治疗脑部疟疾的新策略。
参考文献：
Zhao, S.; Duan, H.; Yang, Y.; Yan, X.; Fan, K., Fenozyme Protects the Integrity of the Blood–Brain Barrier against Experimental Cerebral Malaria. Nano Letters 2019.
https://doi.org/10.1021/acs.nanolett.9b03774
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