Nat Commun︱丁伟/张琪团队合作揭示超级抗生素darobactin的生物合成机制
撰文︱郭思佳
责编︱王思珍
抗生素广泛应用至今，细菌耐药性的发生、发展成为预防、控制细菌感染性疾病的主要障碍，并日益严重威胁全球公共卫生。由于革兰氏阴性菌细胞膜结构的特殊性并且含有外排泵系统，使得这类细菌很容易产生耐药性，开发针对革兰氏阴性菌的抗生素变得异常困难。开发新型革兰氏阴性菌抗生素，对于人类的生活和健康具有重大的意义[1, 2]。
Darobactin是2019年从嗜线虫发光杆菌的代谢产物中发现的一种新型核糖体肽（ribosomally synthesized and post-translationally modified peptide，RiPP），其对于多种革兰氏阴性菌具有优良的抗菌活性，是自上世纪60年以来发现的第一个具有新骨架的革兰氏阴性菌抗生素[3]。Darobactin含有一个罕见的醚键-碳碳键双环交联结构，使其以高亲和力靶向细菌外膜BamA蛋白，抑制外膜蛋白的装配[4]。Darobactin的生物合成基因簇（Biosynthesis Gene Clusters，BGC）含有5个基因：darA编码前体肽，darE编码SAM自由基酶（radical S-adenosylmethionine enzyme，rSAM），darBCD编码ABC型转运蛋白。由于darobactin独特的生物活性，其生物合成机制引起了广泛的关注，目前国际上有多个课题组进行了相关研究[5-7]，然而其详细生物合成机制，尤其是其独特双环的形成机制尚不清楚。
2022年4月29日，上海交通大学生命科学技术学院、微生物代谢国家重点实验室丁伟副教授、复旦大学化学系张琪教授课题组合作在Nature Communications上发表了题为“Radical SAM-dependent ether crosslink in daropeptide biosynthesis”的研究论文。文章解析了SAM自由基酶DarE的催化功能和催化机制，揭示了超级抗生素darobactin独特的双环形成机制。
为了对DarE的功能进行鉴定，作者选取Photorhabdus khanii HGB1456的darobactin 生物合成基因簇作为研究对象。与国外课题组聚焦于检测成熟的darobactin化合物这一研究策略不同，本文作者将带有His-tag标签的前体肽DarA与SAM自由基酶DarE在大肠杆菌中异源共表达，并对纯化多肽进行Trypsin酶解，高分辨质谱（LC-HRMS）结果显示DarE负责催化核心肽的W1和W3之间形成C-O-C键、K5与W3之间形成C-C键，从体内角度清楚证明了DarE的催化功能（图1a）。此外，作者在DarE失活突变体共表达实验中检测到只含有前导肽的截短肽段（图1b），推测异源宿主E.coli中存在非特异性的水解酶参与前导肽和后随肽的切除，随后结合细胞裂解液转化实验，对上述猜想做出验证。
图1 DarApk与DarEpk体内共表达研究
（图源：Guo S, Wang S, et al., Nat Commun, 2022）
在对DarE进行了严格的体外生化活性鉴定时，作者发现DarE催化双环结构形成是分步的，W1和W3之间的C-O-C醚键交联为第一步，K5与W3之间形成C-C键连接为第二步（图2a, b）。作者在反应混合物中意外检测到前体肽Trp51脱氢形成dhW（脱氢色氨酸）中间体（图2c），进一步结合H218O体外测活实验，证实DarE通过一个全新的SAM自由基酶机制，将水分子的氧原子插入到两个色氨酸之间，形成关键的醚键交联（图2d）。
图2 DarEpk体外生化研究
（图源：Guo S, Wang S, et al., Nat Commun, 2022）
综合体内、体外实验结果，作者推测出DarE催化C-O-C键形成机制（图3）：DarE还原性裂解SAM，生成高活性的5'-dAdo自由基和甲硫氨酸，随后自由基攫取前体肽DarA Trp51侧链上的氢原子，生成含有dhW的中间产物，dhW水合并进一步去质子化后产生一个以氧为中心的自由基中间体X，然后该中间体进攻Trp49的吲哚环C7位以形成醚键连接。
图3 推测的DarE催化机制
（图源：Guo S, Wang S, et al., Nat Commun, 2022）
详细的基因组挖掘分析表明，自然界中存在多类darobactin的结构类似物（图4），作者将此类具有特征醚键的化合物命名为daropeptide。为证实该类化合物的结构，作者选择了来源于Yersinia intermedia的基因簇，对其编码的化合物进行详细核磁表征，结果表明由SAM自由基酶催化核心肽W1与W3之间形成醚键交联，W3与Arg5之间形成碳碳键交联；作者同时也选择了来源Photorhabdus asymbiotica的基因簇，对其编码化合物进行了表征，证实其为一类新型的仅含醚键单环的化合物。作者也对相应的多个DarE同源酶进行了详细的底物特性考察，结果表明DarE具有一定的底物混杂性。
图4 Darobactin生物合成基因簇的多样性分析
（图源：Guo S, Wang S, et al., Nat Commun, 2022）
综上所述，该研究首次从体内、体外两方面严格证实DarE负责形成darobactin独特双环结构，并确定醚键的形成先于碳-碳键，揭示了一种全新的SAM自由基依赖的醚键形成机制，同时，研究还揭示darobactin结构类似物在自然界广泛存在，并具有丰富的结构多样性。相关研究为daropeptide的深度挖掘和合成生物学研究奠定了坚实的基础，为新型核糖体肽类阴性菌抗生素的开发提供了新的契机和思路。
原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-30084-2
上海交通大学硕士研究生郭思佳、复旦大学博士后王舒为论文并列第一作者，复旦大学博士研究生马溯泽也参与了该研究。上海交通大学丁伟副教授和复旦大学张琪教授为论文的共同通讯作者。该研究获得国家自然科学基金委项目和国家重点研发项目的支持。
通讯作者：丁伟（左），张琪（右）
（照片提供自：丁伟/张琪团队）
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参考文献（上下滑动阅读）
1. Brown, E. D. & Wright, G. D. (2016) Antibacterial drug discovery in the resistance era, Nature. 529, 336-43.
2. Lewis, K. (2020) The Science of Antibiotic Discovery, Cell. 181, 29-45.
3. Imai, Y., Meyer, K. J., Iinishi, A., Favre-Godal, Q., Green, R., Manuse, S., Caboni, M., Mori, M., Niles, S., Ghiglieri, M., Honrao, C., Ma, X., Guo, J. J., Makriyannis, A., Linares-Otoya, L., Bohringer, N., Wuisan, Z. G., Kaur, H., Wu, R., Mateus, A., Typas, A., Savitski, M. M., Espinoza, J. L., O'Rourke, A., Nelson, K. E., Hiller, S., Noinaj, N., Schaberle, T. F., D'Onofrio, A. & Lewis, K. (2019) A new antibiotic selectively kills Gram-negative pathogens, Nature. 576, 459-464.
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5. Groß, S., Panter, F., Pogorevc, D., Seyfert, C. E., Deckarm, S., Bader, C. D., Herrmann, J. & Müller, R. (2021) Improved broad-spectrum antibiotics against Gram-negative pathogens via darobactin biosynthetic pathway engineering, Chem Sci. 12, 11882-11893.
6. Wuisan, Z. G., Kresna, I. D. M., Bohringer, N., Lewis, K. & Schaberle, T. F. (2021) Optimization of heterologous Darobactin A expression and identification of the minimal biosynthetic gene cluster, Metab Eng. 66, 123-136.
7. Bohringer, N., Green, R., Liu, Y., Mettal, U., Marner, M., Modaresi, S. M., Jakob, R. P., Wuisan, Z. G., Maier, T., Iinishi, A., Hiller, S., Lewis, K. & Schaberle, T. F. (2021) Mutasynthetic Production and Antimicrobial Characterization of Darobactin Analogs, Microbiol Spectr. 9, e0153521.
制版︱王思珍
本文完