Front Cell Dev Biol︱周波课题组揭示影响断奶仔猪混群后攻击行为的分子机制
撰文︱徐庆磊，周波
责编︱王思珍
猪断奶混群后的攻击行为是一项重要的动物福利问题，会对猪的生长性能、饲料转化率、免疫力和肉质产生负面影响，从而影响养猪业的经济效益[1]。先前的研究表明，攻击行为受环境因素的影响，例如饲养密度、混群等[2-3]。然而，遗传因素对猪的攻击行为也有重要影响[4]。由于其复杂的评估过程，传统的猪育种中很少考虑猪的攻击性。猪的攻击性状具有中等遗传力，且个体之间存在差异[5]，这使得通过遗传选育降低猪的攻击性成为可能。因此，识别与猪的攻击行为有关的分子遗传标记可能有助于选育攻击性较弱的猪。
在筛选影响猪攻击行为的候选基因时，猪Rho GTP酶激活蛋白24（Rho GTPase–activating protein 24，ARHGAP24）基因引起了作者的注意。先前的研究表明，ARHGAP24基因与轴突和树突的生长和分支有关[6]。与此同时，据报道，攻击行为与人类的轴突引导信号通路有关[7-8]。因此，ARHGAP24基因可能在调节轴突引导过程中发挥重要作用，进而影响攻击行为。此外，之前的研究还发现，ARHGAP24基因与人类抑郁症[9]和伴有攻击行为的儿童自闭症[10]有关，也与猪的生长性能有关[11]。然而，ARHGAP24基因在调节猪攻击行为中的作用尚不清楚。
2022年4月1日，南京农业大学动物科技学院的周波课题组在《细胞与发育生物学前沿》（Frontiers in Cell and Developmental Biology）上发表了题为“A Single-Nucleotide Polymorphism in the Promoter of Porcine ARHGAP24 Gene Regulates Aggressive Behavior of Weaned Pigs After Mixing by Affecting the Binding of Transcription Factor p53”的研究论文。徐庆磊为论文的第一作者，周波教授为论文通讯作者。该研究提出了猪的攻击行为与ARHGAP24基因有关。鉴定了ARHGAP24基因的功能性SNPs，并阐述了SNPs对混群后断奶仔猪的攻击行为调节的分子机制。该研究为猪的攻击行为性状的遗传改良提供了重要的分子标记，同时也为研究儿童和青少年的攻击行为提供了有价值的信息。
作者首先通过对224头猪的ARHGAP24基因的整个编码区，5'-和3'-侧翼区进行测序，共鉴定了10个SNPs。之后作者将这10个SNPs与猪的攻击行为进行关联分析，结果表明在猪断奶混群后的前2小时内，所有 SNPs 都与多种攻击行为显著相关。有趣的是，在混群后的前2、24、48或72小时内，5'侧翼区域共有3个SNPs（rs339198696、rs344700648和rs335052970）与攻击行为显著相关（p < 0.05）。其中，与猪的攻击行为关联性最强的SNP为rs335052970。在该位点具有AA基因型个体在混群后的前2、24、48或72小时内的攻击行为指数（composite aggressive score，CAS）、主动攻击时间、主动攻击频率、对峙频率和赢的次数均高于GG基因型的猪（p < 0.05）（图1）。
图1 ARHGAP24基因中SNP rs335052970与猪断奶混群后前2、24、48或72小时内的攻击行为的关联分析
（图源：Xu Q et al., Front Cell Dev Biol, 2022）
有研究表明位于核心启动子区域的SNP通过影响与转录因子的结合来影响 mRNA 转录[12]。为了进一步分析鉴定到的与攻击行为有关的SNPs是否影响猪ARHGAP24 基因的转录，作者对猪ARHGAP24基因的启动子进行了鉴定与活性分析。结果表明：ARHGAP24基因的核心启动子区域位于-670和-1113 bp之间，而负调控启动子区域位于-308和-33 bp之间（图2A）。有趣的是，包括与猪的攻击行为关联性最强的SNP rs335052970和另外两个与之连锁不平衡的SNPs（rs344700648和rs339198696）也位于核心启动子区，并形成三种单倍型：H1（AAC）、H2（GAA）和H3（GTA）。通过构建不同等位基因和单倍型的重组荧光素酶表达载体，作者发现含有rs335052970的G等位基因的质粒的荧光素酶活性高于含有 A 等位基因的质粒（p < 0.01）（图2B）。含有单倍型GAA 的质粒的相对荧光素酶活性最高，而含有单倍型 AAC 的质粒的相对荧光素酶活性最低（p < 0.01）（图2C）。这表明影响启动子活性的位点是 rs335052970（-744 G > A）。
图2 用于猪ARHGAP24启动子活性分析的荧光素酶测定（pGL3-basic作为阴性对照，pGL3-control作为阳性对照）
（图源：Xu Q et al., Front Cell Dev Biol, 2022）
为了进一步探究ARHGAP24基因的SNP rs335052970突变是如何影响基因的表达的，作者使用生物信息学软件预测SNP突变对转录因子结合位点的影响。作者发现rs335052970的等位基因A位于转录因子p53的靶启动子的特异序列中。作者通过染色质免疫沉淀（chromatin immunoprecipitation，ChIP）试验证明了p53在体内直接与转录因子结合元件（transcription Factors binding element，PBE）基序结合（图3A）。为了研究p53是否通过PBE位点调节ARHGAP24的表达，作者将靶启动子的特定片段克隆到荧光素酶报告基因上（图3B），并与转录因子表达质粒共转染到猪神经细胞中（图3C）。结果表明：pcDNA3.1-p53组中p53的mRNA 表达水平高于对照组（p < 0.05）（图4A）。siRNA-p53 组中p53的mRNA表达水平低于对照组（p < 0.05）（图4B），这证实了转染效果。当转录因子p53过表达时，pcDNA3.1-WT 组的荧光素酶活性低于pcDNA3.1-MUT组（p < 0.05）（图4 C）。此外siRNA-p53 组的荧光素酶活性高于对照组（p < 0.05）（图4 D）。p53的过表达降低了ARHGAP24的 mRNA 和蛋白质表达水平（p < 0.01）（图4E, G），但干扰p53增加ARHGAP24的 mRNA 表达水平（p < 0.01）（图4F, H）。这表明转录因子p53能够靶向结合ARHGAP24基因，并且可以调节猪神经细胞中ARHGAP24基因的表达。
图3 转录因子p53靶向结合猪神经细胞中ARHGAP24基因的结合元件（ PBE）基序。
（图源：Xu Q et al., Front Cell Dev Biol, 2022）
图4 转录因子p53 调节猪神经细胞中ARHGAP24基因的表达。
（图源：Xu Q et al., Front Cell Dev Biol, 2022）
为了探究ARHGAP24基因参与的轴突引导信号通路如何调节攻击行为以及在p53过表达或抑制时通路中相关基因的变化，作者将构建的真核表达载体pcDNA3.1（+）（pcDNA3.1- p53）和化学合成的siRNA-p53和siRNA-ARHGAP24转染到猪神经细胞中，检测轴突导向通路相关基因的表达水平。pcDNA3.1-p53组RHOA基因mRNA表达水平高于对照组（p < 0.05）（图5A），而 siRNA-p53 组 RHOA基因 mRNA 表达水平低于对照组（p < 0.05）（图5B）。同样地，pcDNA3.1-p53组ROCK1基因mRNA表达水平较对照组有升高趋势（p = 0.0567）（图5C），而siRNA-p53组ROCK1基因mRNA表达水平为小于对照组（p < 0.05）（图 5D）。相比之下，pcDNA3.1-p53组RAC1基因的mRNA 表达水平低于对照组（p < 0.05）（图5E），而siRNA-p53组RAC1基因的mRNA 表达水平高于对照组（图5F）。此外，siRNA-ARHGAP24组RHOA 和ROCK1基因的mRNA表达水平高于对照组（p < 0.05）（图5G,H）。然而，RAC1基因的mRNA表达水平在siRNA-ARHGAP24和对照组之间没有差异（图5I）。这表明转录因子p53通过靶向结合ARHGAP24基因激活轴突引导通路。
图5 转录因子p53调节猪神经细胞中轴突引导通路相关基因的表达
（图源：Xu Q et al., Front Cell Dev Biol, 2022）
图6 ARHGAP24基因SNP rs335052970对断奶仔猪混群后的攻击行为的调控假说图。
（图源：Xu Q et al., Front Cell Dev Biol, 2022）
综上所述，作者通过对猪ARHGAP24基因测序，总共鉴定到10个SNPs。通过关联分析，作者发现有9个SNPs与猪的攻击行为显著相关。其中位于核心启动子区的SNP rs335052970与攻击行为的关联性最强。作者还证明了在猪的原代神经细胞中，转录因子p53靶向结合含有rs335052970的等位基因A的靶启动子片段，降低其启动子转录活性，进而降低ARHGAP24的mRNA和蛋白表达。此外，作者还验证了转录因子p53能够激活轴突引导信号通路基因的表达。轴突引导通路据报道能够调节攻击行为[13]。同时，ARHGAP24基因的下调会抑制了轴突和树突的生长和分支[14]。因此，p53可能通过抑制ARHGAP24基因的表达来减少轴突生长和树突分支，从而使断奶后的猪更具攻击性（图6）。
当然，该研究还存在一些有待解决的问题，比如，还需要进一步的体外功能研究来验证转录因子p53是如何影响猪的攻击行为的。此外，还需寻找更多的关于 ARHGAP24基因调控猪攻击行为的科学证据。
总之，该研究首次证明了ARHGAP24基因对猪的攻击行为具有显著的遗传效应。ARHGAP24基因中的SNP rs335052970可以作为分子标记来选育攻击性较小的猪。此外，猪作为研究人类神经系统疾病的重要的生物医学模型动物，该研究也为寻找与儿童和青少年攻击行为相关的分子标记提供了借鉴。
原文链接：https://www.frontiersin.org/articles/10.3389/fcell.2022.839583/full
文章第一作者徐庆磊（左4），第二作者赵静（左3），第三作者郭晏利（左2）；通讯作者周波教授（左5）
（照片提供自：南京农业大学动物科技学院周波实验室）
本文受到国家自然科学基金（32172786，31672465）的资助。周波教授团队的主要研究方向是猪生长与行为遗传育种及抗生素替代品在猪生产中的应用。周波教授团队网页介绍：https://dky.njau.edu.cn/info/1101/2302.htm。
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制版︱王思珍
本文完