Autophagy︱张惠敏课题组揭示表皮结构损伤对自噬的双向调控机制
撰文︱傅 容
责编︱王思珍
上皮组织构成了我们大多数器官的物理屏障，并不断面临物理损伤和结构破坏的挑战。然而，上皮细胞的结构损伤是否以及如何影响受损细胞本身的自噬仍不完全清楚。已有证据表明，上皮细胞内多种类型的机械支撑结构参与调节自噬过程。首先，当上皮层脱离细胞外基质的粘附支持时，可以诱导自噬发生，这一过程被称为“细胞解离诱导的自噬”[1-4]。这种现象主要是由细胞粘附结构的破坏或细胞外基质成分的变化引起的[5]。其次，肌动蛋白丝和微管等细胞骨架纤维不仅直接参与自噬小体的形成和运输，还通过与BECN1/Beclin 1、BCL2L11/BIM或其他关键自噬蛋白相互作用来调节其功能[5, 6]。虽然中间纤维不直接参与自噬小体的形成，但研究发现它可以通过与BECN1的结合抑制自噬[7]。再次，机械张力的变化也可以直接影响自噬过程[8, 9]。总之，这些发现表明上皮细胞的结构完整性可能对自噬过程具有复杂的影响。然而，上述研究相对比较零散，且大多是在体外培养的细胞中进行的。目前仍缺乏在活体内对上皮细胞应对结构损伤的自噬调节机制及其生理意义的全面系统的分析。
2022年3月21日，苏州大学生物医学研究院的张惠敏教授课题组在Autophagy杂志发表了题为“Bidirectional regulation of structural damage on autophagy in the C. elegans epidermis”的研究论文。傅容博士和蒋晓婉博士为论文共同第一作者，张惠敏教授为论文通讯作者。该研究利用秀丽隐杆线虫作为模式生物揭示了表皮结构损伤双向调节细胞内自噬过程的分子机制。
为了研究机械损伤后线虫表皮细胞中自噬的调节方式，研究者使用表皮特异性启动子驱动GFP标记的LGG-1/Atg8报告系统显示自噬小体的形成[10]。表皮机械损伤采用微米级显微注射针对线虫表皮进行穿刺来完成。有趣的是，表皮细胞内单一伤口的附近没有观察到自噬现象，而在远离伤口的区域发生了明显的自噬。但在表皮细胞内部制造多个伤口时，则整个表皮均不会引起明显自噬（图1A-B）。这些观察结果可以用如下假设来解释：机械损伤抑制伤口附近自噬小体的形成，但促进远离伤口区域的自噬小体的形成。因此，在多处损伤的情况下，单个创伤诱导的自噬小体可能会被另一个创伤阻断。为了证实机械损伤对自噬小体形成的近端抑制作用，研究者通过热激处理诱导自噬，然后在表皮上施加多处创伤。与假设一致的是，多处伤口消除了热激诱导的自噬小体的形成（图1C-D）[11]。综上所述，研究者认为机械损伤对同一表皮细胞内的自噬具有近端抑制作用和远端促进作用。
图1 机械损伤对线虫表皮自噬既有促进作用，也有抑制作用
（图源：Fu R, et al., Autophagy, 2022）
为了分析表皮结构损伤对自噬的不同影响，研究人员通过RNA干扰或药物处理破坏不同类型的表皮支撑结构，并使用表皮特异性启动子Pdpy-7驱动的GFP::LGG-1报告系统分析它们对自噬反应的影响。结果发现只有底部细胞外基质（UNC-52）或相邻肌肉结构（UNC-112）的损伤显著增加了表皮中的自噬小体的数量以及LGG-1-II的水平（图2A-C）。由于诱导自噬的激活或抑制自噬的降解均可导致以上现象。为了区分这两种可能性，研究者使用epg-5突变体来检测自噬流的情况。在epg-5突变体中，降解性自噬溶酶体的形成被阻断，导致自噬小体的积累（图2D-E）[12]。自噬的激活会加剧epg-5突变体中自噬小体的积累，而自噬的降解缺陷则不能[13-14]。基底膜结构损伤（unc-52 RNAi）增加了epg-5突变体表皮中自噬小体的数量（图2D-E）。这一结果表明，表皮的自噬确实在基底膜结构损伤后被激活。与这一结果一致的是，荧光报告和western blot分析显示，表皮细胞中的自噬底物蛋白SQST-1/SQSTM1的水平也因unc-52的缺失而减少（图2F-G）。总之，这些结果表明：表皮基底支撑结构的破坏可促进表皮中自噬小体的形成。
图2 表皮基底结构破坏促进自噬反应
（图源：Fu R, et al., Autophagy, 2022）
由于LGG-1脂质化分析表明，顶部半桥粒受体MUP-4的破坏可能会抑制自噬本底水平（图2C），研究者接下来想更详细地研究半桥粒破坏对自噬的负向调节。首先，他们在线虫表皮中采用了两种自噬诱导条件，即热激和百草枯处理[11,15]。接下来，他们利用RNAi破坏半桥粒的主要成分，包括顶部半桥粒受体MUP-4、底部半桥粒受体LET-805和中间纤维蛋白IFB-1。结果表明，只有MUP-4的缺失才导致由不同原因诱导的自噬小体显著减少（图3A-C），这表明自噬诱导特异性地受到顶部表皮结构破坏的抑制。最近有报道称，半桥粒破坏可激活表皮细胞内的溶酶体[16]，这增加了另一种可能性，即MUP-4缺失导致自噬小体的减少可能是由于溶酶体激活导致自噬小体降解增快所致。然而，后续实验结果发现，当自噬溶酶体降解被epg-5失活阻断时，mup-4 RNAi处理仍然会明显减少自噬小体的数量（图3D-E），因此排除了溶酶体激活的影响[13,14]。对自噬降解底物SQST-1的分析也表明，顶端半桥粒的破坏确实降低了表皮细胞的自噬活性（图3F-H）。这些观察结果表明：顶端表皮黏着结构的破坏对自噬过程具有抑制作用。
图3 表皮顶部结构破坏抑制自噬的激活
（图源：Fu R, et al., Autophagy, 2022）
根据基底膜的破坏和相邻肌肉结构的缺损都会激活表皮细胞自噬的发现（图2A-B），研究者推测自噬的增加可能是由于表皮细胞接受的肌肉张力信号的丧失所致。与这一假设一致的是，破坏其他肌肉结构成分或用muscimol药物处理直接抑制肌肉收缩均可增加表皮细胞的自噬小体（图4A-C）。这些实验结果说明肌肉张力的丧失足以刺激表皮的自噬反应。此外，muscimol处理没有进一步增强unc-52缺失诱发的自噬，这表明基底膜结构损伤通过与张力缺失相同的途径诱发表皮自噬（图4B-C）。总之，这些结果表明：基底结构损伤时表皮自噬活性的增加是由机械张力的丧失引起的。由于LET-805是连接肌肉细胞和表皮的底部半桥粒受体[17]，研究者检测了肌肉张力是否通过LET-805调节自噬过程。与假设一致的是，let-805的缺失显著抑制了张力丧失诱导的表皮自噬小体的形成（图4D-E）。有趣的是，let-805的缺失并没有抑制由热激或百草枯等其他因素引起的自噬水平上调（图3A-C）。这表明LET-805特异性介导机械张力信号和表皮自噬过程。MTOR不仅是自噬诱导的关键调节因子，也是机械转导的关键调节因子[9,18-19]，这促使研究者检测了MTOR是否参与结构损伤后张力缺失导致的自噬激活。结果发现，在let-363（MTOR的线虫同源蛋白）被敲降的表皮细胞中，muscimol没有诱导更多的自噬小体的形成，这表明张力丧失和MTOR失活是通过相同的途径促进自噬（图4F-G）。支持这一假设的是，unc-52缺失下调了MTOR的磷酸化水平，说明基底膜结构破坏抑制MTOR的活性（图4H）[20]。综上所述，研究者认为：基底结构损伤的表皮细胞可以通过LET-805-MTOR信号通路将机械张力信号的变化转为胞内自噬反应。
图4 表皮基底结构损伤通过底部半桥粒受体和LET-363/MTOR介导的机械转导途径促进自噬
（图源：Fu R, et al., Autophagy, 2022）
接下来，研究者探索了结构损伤抑制表皮细胞自噬的机制。此前有报道称，机械性损伤线虫表皮会触发损伤部位周围钙离子信号的增加[21]。研究者注意到，在针刺损伤后，钙离子的分布区域与自噬小体的分布区域是互补的。也就是说，在自噬活性较低的地方，钙离子水平较高（图5A）。与针刺损伤类似的是，顶端半桥粒受体MUP-4的破坏也会升高表皮细胞内钙离子水平（图5B-C）。因此，研究者推测表皮结构损伤后钙离子内流的激增可能是抑制自噬的原因。与该假设一致的是，钙离子通道蛋白gtl-2失活抑制钙离子内流可导致自噬过程增强（图5D-E）[21]。此外，gtl-2突变体中的自噬激活可以被补充的钙离子抑制，但不能被针刺损伤抑制（图5D-G）。gtl-2功能的丧失也消除了mup-4失活对自噬的抑制作用（图5H-I）。总之，这些结果表明：表皮细胞结构损伤确实以钙依赖的方式抑制自噬。
图5 表皮顶部结构损伤通过提高钙离子信号抑制自噬
（图源：Fu R, et al., Autophagy, 2022）
为了研究自噬过程对细胞结构损伤应答的生理意义，研究者首先分析了自噬对表皮伤口修复的影响。结果表明，不管是自噬基因atg-18突变体导致的自噬抑制还是let-363 RNAi导致的自噬增强均未显著影响伤口处的肌动蛋白环的形成（图6A-C）[21]。然而，自噬似乎会影响生物体在结构损伤情况下的生存能力。通过自噬基因atg-3突变抑制自噬过程，显著挽救了基底膜蛋白UNC-52缺陷的线虫的存活率（图6D）。相反，通过gtl-2突变提高自噬水平则会增加顶部结构蛋白MUP-4破坏的线虫的死亡率（图6E）。这些数据表明，过度的自噬活动可能会降低机体对表皮结构损伤的耐受性。考虑到自噬在某些情况下可能触发细胞凋亡[22,23]，研究者检测了细胞凋亡是否参与了自噬对结构损伤耐受的不利影响。Hoechst染色显示，unc-52 RNAi处理的线虫表皮呈现出染色质固缩的细胞凋亡特征（图6F-H）。而通过自噬突变体抑制自噬过程则改善了unc-52 RNAi诱导的表皮细胞核凋亡特征（图6F-H）。这些观察结果表明：自噬可通过加重细胞凋亡对表皮结构受损的生物体产生有害影响。
图6 过高的自噬水平不利于表皮细胞对结构损伤的耐受
（图源：Fu R, et al., Autophagy, 2022）
图7 秀丽线虫表皮结构破坏双向调节自噬的机制模式图
（图源：Fu R, et al., Autophagy, 2022）
综上所述，该研究提出了一个结构损伤调节表皮细胞自噬过程的模型：表皮细胞支撑结构的破坏可以同时诱导和抑制自噬。自噬诱导是通过表皮基底结构损伤引起的机械张力减弱来介导的，而自噬抑制主要是通过表皮顶端结构损伤触发的钙信号通路的上调来实现的。此外，自噬水平的升高对秀丽线虫表皮应对结构损伤是不利的（图7）。研究者认为，受损的表皮细胞可能通过释放自噬抑制信号，以抵消自噬上调造成的损伤。而机械损伤对单个上皮细胞自噬的最终影响可能取决于被破坏的支撑结构的类型、位置和损伤程度。
当然，这项研究还存在一些有待解决的问题，比如表皮细胞底部半桥粒受体如何调节MTOR的活性，表皮顶部机械支撑结构调控钙离子信号的分子机制是什么，以及自噬对细胞耐受结构损伤的具体影响和调节机制仍有待进一步研究。
总之，本研究工作可以帮助人们更好地理解上皮结构完整性对自噬相关生物学过程的影响，并为自噬或上皮细胞结构损伤相关的各种疾病的发病机制提供理论支持。
原文链接： https://doi.org/10.1080/15548627.2022.2047345
第一作者傅容（前排右一），共同第一作蒋晓婉（后排左三），参与作者杨玉妍（后排左二），王春霞（后排右二），张云（后排左一），朱怡（后排右一）
（照片提供自：苏州大学张惠敏实验室）
苏州大学生物医学研究院张惠敏教授为本论文的通讯作者，傅容博士为本文排名第一作者，蒋晓婉博士为本文共同第一作者，本研究还得到了中科院生物物理所的张宏教授、王晓晨教授以及云南大学的杨崇林教授团队的技术支持。本研究受中国国家自然科学基金、江苏省自然科学基金、教育部长江学者与创新团队发展计划和江苏省高校优势学科建设工程资助。
张惠敏教授带领的团队主要利用秀丽隐杆线虫模式生物研究上皮细胞三维支撑结构对细胞内物质合成，代谢，应激保护和免疫应答等多个生命过程的上游调控作用。研究工作发表在Nature 、Immunity、PNAS、Cell Reports等多个学术期刊。更多信息请查询网页http://ibms.suda.edu.cn/3479/list.htm。
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制版︱王思珍
本文完