Cell Death Differ︱尹海芳团队揭示杜兴肌肉萎缩症新作用机制：转录因子Wt1激活心外膜细胞分化促进心肌纤维化

撰文︱郭正隆，尹海芳

责编︱王思珍 

杜兴肌肉萎缩症（Duchenne muscular dystrophy，DMD）是一种由于DMD基因突变引起的伴X染色体隐性遗传病，多发于男性，主要表现为全身性肌肉进行性萎缩，严重危害青少年身体健康[1]。随着患者护理和呼吸支持技术的发展，心肌纤维化引起的心肌肥大失调已经成为DMD患者死亡的主要原因[2]。尽管寡核苷酸等多种药物可以抑制DMD患者骨骼肌的纤维化和坏死，但对心肌纤维化的改善并不明显[3]。深入解析心肌纤维化的发生、发展过程和分子调控机制，有助于筛选药物靶点，研发有效的改善DMD心脏功能的治疗手段。

心外膜细胞通过上皮-间充质转化（epithelial-to-mesenchymal transition，EMT），形成心外膜来源细胞（EPDCs），EPDCs具有向多种心系细胞分化的潜能，参与心脏发育与重塑[4-6]。转录因子Wilms’ tumor 1（Wt1）被证实调控心外膜细胞EMT和分化，在心梗模型心肌纤维化发展过程中发挥重要功能[7-8]。然而，Wt1是否在DMD进行性心肌纤维化中发挥作用，以及具体的调控分子机制，目前仍不清楚。

2022年3月19日，天津医科大学尹海芳课题组于Cell Death & Differentiation杂志发表了题为“Upregulation of Wilms’ Tumor 1 in epicardial cells increases cardiac fibrosis in dystrophic mice”的研究论文，利用端粒酶敲除DMD模型小鼠mdx/mTR^-/-，首次阐释了炎症因子介导NF-κB 信号通路激活Wt1的表达，诱导心外膜细胞向成纤维细胞分化，促进DMD心肌纤维化的分子机制，并且提出二甲双胍可以作为一种有效的抑制DMD心肌纤维化的候选治疗药物。

一、 DMD小鼠心肌纤维化过程中伴随Wt1的表达升高和心外膜细胞EMT的激活

为了建立Wt1的表达水平与DMD心肌纤维化的相关性，作者首先建立了更接近于DMD病人心肌病表型的端粒酶敲除mdx小鼠模型：mdx/mTR^-/-，通过表型鉴定发现：8月龄F3代mdx/mTR^-/-小鼠表现出明显的心肌纤维化和心脏功能失调。Wt1的表达检测和定量结果显示：mdx/mTR^-/-小鼠心外膜上Wt1⁺细胞数量显著增加，并且与成纤维细胞特异性蛋白vimentin存在明显共定位（图1），提示Wt1的表达升高、心外膜细胞的激活、EMT与分化与DMD小鼠心肌纤维化正相关。

图1 DMD小鼠心脏wt1表达上调

（图源：Guo, et al., Cell Death Differ, 2022）

二、 过表达Wt1蛋白促进mdx/mTR^-/-小鼠心肌纤维化

为进一步确立Wt1激活对DMD小鼠心肌纤维化的调控作用，作者通过腺病毒AAV9在mdx/mTR^-/-小鼠心脏中过表达Wt1。通过心脏胶原染色和心脏超声检测发现，Wt1的过表达会加快mdx/mTR^-/-小鼠心肌纤维化进程，造成明显的心脏收缩功能和舒张功能的失调（图2），确立了Wt1蛋白的表达上调能够显著性的促进DMD小鼠心肌纤维化。

图2 过表达Wt1促进DMD小鼠心肌纤维化

（图源：Guo, et al., Cell Death Differ, 2022）

三、 炎症信号通路调控DMD小鼠心外膜细胞Wt1的表达

NF-κB是Wt1上游的调控因子，并且与炎症的激活密切相关[9]，因此作者推测炎症因子可能会作用于心外膜细胞，激活NF-κB信号通路，进而调控Wt1的表达和心外膜细胞的分化。为了证明这一推测，作者检测了mdx/mTR^-/-小鼠心脏中炎症因子和NK-κB信号分子的表达，发现随着月龄的增加，DMD小鼠心脏表现出进行性的炎症因子TNF-a、IL-1β的增加。同时NF-κB信号通路的激活和Wt1⁺细胞的激活与炎症因子的表达正相关（图3），这些数据表明：DMD心脏中，慢性炎症的发展会激活NF-κB信号通路，诱导心外膜细胞Wt1的表达升高，进而调控心外膜细胞的EMT和分化。

图3 NF-κB 通路调控DMD小鼠心外膜细胞Wt1表达

（图源：Guo, et al., Cell Death Differ, 2022）

四、 抑炎药物二甲双胍可以有效的改善DMD小鼠心肌纤维化

既然炎症是导致DMD小鼠心外膜细胞Wt1表达升高的原因，那么是否可以通过抑制炎症的发展减缓DMD心肌纤维化的进程呢？二甲双胍（Metformin）作为临床上广泛应用的药物，被证实在具有抑制炎症发展的作用，通过为期两个月的给药，结合体外实验结果，作者发现：二甲双胍可以显著性的抑制炎症和NF-κB通路的激活，进而维持Wt1的表达水平，减慢DMD小鼠心肌纤维化的进程，改善DMD小鼠心脏功能（图4）。

图4 二甲双胍改善DMD小鼠心肌纤维化

（图源：Guo, et al., Cell Death Differ, 2022）

图5 工作总结图：Wt1调控DMD心肌纤维化作用机制

（图源：Guo, et al., Cell Death Differ, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究首次在杜兴肌肉萎缩症（DMD）模型鼠上，发现炎症调控Wt1表达并参与心肌纤维化的作用机制，提出炎症信号-NF-κB通路可以作为DMD心肌纤维化治疗的靶点。同时，将机制研究与临床应用相结合，证实临床药物二甲双胍，可以有有效地抑制NF-κB通路的激活，显著性改善DMD小鼠心肌纤维化和心脏功能，为DMD临床病人心肌病变的治疗提供了新的思路和候选药物（图5）。

当然，由于药物的多效性，作者不能排除二甲双胍通过其他方式抑制DMD小鼠心肌纤维化；且二甲双胍在DMD患者中的临床研究只局限于骨骼肌，并未深入探讨其对心肌纤维化和心脏功能的改善作用。基于本研究中二甲双胍对DMD小鼠炎症和心肌纤维化作用新机制，作者相信可将二甲双胍和反义寡核苷酸等药物联合使用，可能为DMD患者全身性肌肉萎缩的功能改善提供新的治疗策略。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41418-022-00979-0

天津医科大学尹海芳教授为论文通讯作者，郭正隆博士和耿梦缘博士为共同第一作者，该工作得到天津医科大学王峰教授和天津中医药大学樊官伟教授的支持，以及国家自然科学基金和天津医科大学卓越人才计划及“十三五综投”相关经费资助。尹海芳教授带领“天津-牛津基因治疗联合实验室”团队，长期致力于杜兴肌肉萎缩症和肝癌等疾病的基因治疗和药物靶向运输系统的研发，相关成果以通讯作者发表在在Science Translational Medicine、Nature Communications、Hepatology、Journal of Hepatology、EMBO Molecular Medicine、 Molecular Therapy等学术期刊。

第一作者郭正隆（后排左三）；共同第一作者耿梦缘（前排右四）；通讯作者尹海芳（中间）

（照片提供自尹海芳实验室）

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参考文献（上下滑动查看）  

1. Verhaart IEC, Aartsma-Rus A. Therapeutic developments for Duchenne muscular dystrophy. Nat Rev Neurol 2019, 15(7): 373-386.

2. Silva MC, Magalhaes TA, Meira ZM, Rassi CH, Andrade AC, Gutierrez PS, et al. Myocardial Fibrosis Progression in Duchenne and Becker Muscular Dystrophy: A Randomized Clinical Trial. JAMA Cardiol 2017, 2(2): 190-199.

3. Zhou L, Lu H. Targeting fibrosis in Duchenne muscular dystrophy. J Neuropathol Exp Neurol 2010, 69(8): 771-776.

4. Simoes FC, Riley PR. The ontogeny, activation and function of the epicardium during heart development and regeneration. Development 2018, 145(7).

5. Gittenberger-de Groot AC, Winter EM, Poelmann RE. Epicardium-derived cells (EPDCs) in development, cardiac disease and repair of ischemia. J Cell Mol Med 2010, 14(5): 1056-1060.

6. Braitsch CM, Yutzey KE. Transcriptional Control of Cell Lineage Development in Epicardium-Derived Cells. J Dev Biol 2013, 1(2): 92-111.

7. Zhou B, Pu WT. Genetic Cre-loxP assessment of epicardial cell fate using Wt1-driven Cre alleles. Circ Res 2012, 111(11): e276-280.

8. Zhou B, Honor LB, He H, Ma Q, Oh JH, Butterfield C, et al. Adult mouse epicardium modulates myocardial injury by secreting paracrine factors. J Clin Invest 2011, 121(5): 1894-1904.

9. Dehbi M, Hiscott J, Pelletier J. Activation of the wt1 Wilms' tumor suppressor gene by NF-kappaB. Oncogene 1998, 16(16): 2033-2039.

制版︱王思珍

本文完