Nat Commun︱王振和/郝宇钧团队发现肿瘤发生新机制：核定位的p85β增强PIK3CA螺旋结构域突变细胞的肿瘤发生
撰文︱李雅木，郝宇钧
责编︱王思珍
PIK3CA基因是人类实体肿瘤中最常见的突变之一[1]，主要编码PI3K复合体中的催化亚基p110α, p110α存在2类热点突变（hotspot），即螺旋结构域（helical domain）和激酶结构域（kinase domain）上的突变。 一般认为，p110α的催化活性受到调控亚基p85的严格调控，正常情况下，p85结合p110α抑制其催化活性，在细胞接受生长因子的刺激后，p85会通过其SH2结构域结合其他带有酪氨酸磷酸化的接头蛋白（adaptor protein）将PI3K复合体招募到细胞膜，从而激活下游通路。
2022年4月13日，凯西西储大学王振和教授、上海交通大学医学院附属仁济医院上海肿瘤研究所郝宇钧教授课题组合作在Nature Communications上发表了题为“Nuclear translocation of p85β promotes tumorigenesis of PIK3CA helical domain mutant cancer”的研究。揭示了在含有PIK3CA 螺旋结构域突变（helical domain mutation）的肿瘤细胞中，p85β从PI3K复合体中解离并通过自身核定位信号进入细胞核，随即招募去泛素化酶USP7到组蛋白甲基转移酶EZH1/2蛋白上增强蛋白稳定性，增加组蛋白H3K27me3的水平，进而促进肿瘤发生。
作者先前的工作已经证明了在含有PIK3CA 螺旋结构域突变（E545K）的肿瘤细胞中，p110α可以直接结合胰岛素受体底物蛋白IRS1，并不完全依赖于p85的调控[2]，为进一步探究在这类突变细胞中p110α 如何影响PI3K复合体的形成，作者在293T细胞中过表达野生型和多种突变型p110α，通过免疫共沉淀的方法，发现在表达螺旋结构域突变的细胞中p85β和p110α的结合能力明显减弱（图1），p85α与p110α的结合并未受到影响。为了进一步了解为何p85β而不是p85α可以从含有PIK3CA螺旋结构域突变的PI3K复合体中解离，作者通过序列比对发现p85β 和p85α的N端序列并不保守，只有56%的同源性，作者推测p85β N端的SH3和GAP区域的氨基酸序列很可能是导致p85β从PI3K 复合体中解离的原因。
图1 p85β从PIK3CA螺旋域突变的PI3K 复合体中解离
（图源：Hao Y, et al., Nat Commun, 2022）
为了探究p85β在含有PIK3CA螺旋结构域突变的肿瘤细胞中的功能，作者首先在含有PIK3CA螺旋结构域突变的DLD1（E545K）、H460（E545K）、SW948（E542K）、以及MDA-MB361（E545K）细胞中敲除或敲低了p85β，这些细胞的体外生长明显收到影响，不仅如此，通过异种移植实验（xenograft），敲除或敲低了p85β的PIK3CA螺旋结构域突变的细胞成瘤能力明显减弱。有趣的是，在含有PIK3CA激酶结构域突变的细胞和WT细胞中敲除或敲低p85β，如RKO（H1047R）、T47D（H1047R）、SW480（WT），并未观察到对体外生长以及体内成瘤有显著影响（图2）， 这些结果显示p85β对于含有PI3KCA螺旋结构域突变的肿瘤细胞的生长以及成瘤是必需的。
图2 敲除p85β显著降低PIK3CA螺旋域突变肿瘤细胞的致瘤性
（图源：Hao Y, et al., Nat Commun, 2022）
接下来作者为了阐释p85β如何在PIK3CA螺旋结构域突变的肿瘤细胞中调控其生长以及成瘤，作者在DLD1（E545K）的p85β WT以及p85β KO细胞中检测了PI3K的下游通路如AKT、GSK3b、FOXO、mTOR、P70S6K，发现无论是饥饿、血清以及生长因子刺激状态，这些下游通路都没有显著性的变化。同时，有研究组报道了p85蛋白有存在核定位的现象[3]，作者通过免疫荧光发现，在PIK3CA螺旋结构域突变的肿瘤细胞中，p85β在胞质区和细胞核都存在广泛定位（图3）。
图3 p85β的细胞核定位
（图源：Hao Y, et al., Nat Commun, 2022）
为了探究p85β如何进入细胞核，通过相关序列软件的预测，核定位信号序列很可能在p85β的474至484氨基酸之间，作者进一步通过定点突变实验发现只需要将477/478位KR突变成AA即可完全阻断p85β的入核。通过遗传学基因敲入技术，作者在DLD1（E545K）细胞中构建了p85β kr-aa的突变细胞株，这类细胞中的p85β并不能进入细胞核，作者检测了突变细胞的体外生长和体内成瘤能力发现和p85β WT细胞（可以入核）相比，突变细胞的致瘤性显著减弱（图4）。这些结果显示p85β的核定位对PIK3CA螺旋结构域突变的肿瘤细胞的致瘤性至关重要。
图4 突变p85β的核定位序列降低DLD1细胞的致瘤性
（图源：Hao Y, et al., Nat Commun, 2022）
为了阐释核定位的p85β如何影响PIK3CA螺旋结构域突变的肿瘤细胞致瘤性的分子机制，作者首先通过RNAseq分析DLD1 parental细胞和p85β kr-aa细胞的转录组变化。发现在突变细胞中有3224个基因上调，2044个基因下调（图5）。由此可见，p85β可能参与了全基因组的表达调控。因此作者在DLD1 WT细胞和p85β kr-aa细胞中检测了组蛋白H3的甲基化水平，发现H3K27me3的修饰水平在突变细胞中显著降低，同时，其他修饰水平如H3K4,H3K9,H3K36等并无明显变化。进一步研究发现负责H3K27甲基化的甲基转移酶EZH1/EZH2在PIK3CA螺旋域突变肿瘤细胞中受到p85β的调控，但在PIK3CA野生型或激酶域突变肿瘤细胞中并不受到p85β的调控。值得注意的是，EZH1/2的mRNA 水平并未收到影响。这些结果显示p85β可能影响到的EZH1/2蛋白的稳定性。ChIP-seq分析发现p85β kr-aa突变细胞基因组上H3K27me3标记显著降低。
图5 p85β调控EZH1/2蛋白水平
（图源：Hao Y, et al., Nat Commun, 2022）
为了进一步探究p85β如何调控EZH1/2的蛋白稳定性，基于有研究组报道了在前列腺癌细胞中去泛素化酶USP7通过去泛素化作用增强EZH1/2的蛋白稳定性[4]，作者提出了大胆的猜测：是否p85β能够招募USP7到EZH从而通过去泛素化作用来增强EZH蛋白的稳定性？为验证这一猜想，作者首先检测了在PIK3CA 螺旋结构域突变的细胞中p85β是否和USP7、EZH有相互作用，通过免疫共沉淀实验发现，在DLD1和MB361这两个含有PIK3CA螺旋结构域突变的细胞中，p85β可以和USP7以及EZH形成复合物，在HCT116含有PIK3CA 激酶结构域突变的细胞中，p85β并不能和USP7以及EZH相互作用。同时，在p85β 基因敲除的DLD1细胞中，USP7和EZH的结合能力显著减弱。在USP7 基因敲除的DLD1细胞中，EZH蛋白的泛素化水平显著增高，表达水平显著降低，H3K27me3修饰水平显著降低（图6）。这些结果显示核定位的p85β能够招募USP7来增强EZH蛋白的稳定性，从而增加H3K27me3的修饰水平。
图6 p85β介导USP7和EZH 形成复合体
（图源：Hao Y, et al., Nat Commun, 2022）
因为在PIK3CA 螺旋结构域突变细胞中的p85β介导了EZH蛋白的稳定性，同时p110α在这类细胞中也是异常激活状态，作者提出假设：在PIK3CA螺旋域突变肿瘤中联合靶向p110α和EZH的药物可能具有更好的肿瘤抑制效果。作者使用了FDA批准的p110α抑制剂Alpelisib和EZH2抑制剂Tazemetostat，异种移植实验结果显示，含有PIK3CA 螺旋结构域突变的肿瘤细胞对于联合用药更为敏感，肿瘤在给药3周内显著消退，而PIK3CA 野生型和激酶结构域突变的肿瘤细胞对于联合用药虽然表现出生长缓慢但是并没有消退的迹象（图7）。这些结果提示了在治疗含有PIK3CA螺旋结构域突变的病人时，联合使用Alpelisib和Tazemetostat可能会作为一个有效的治疗策略。
图7 联合使用Alpelisib和Tazemetostat促进PIK3CA螺旋结构域突变的肿瘤消退
（图源：Hao Y, et al., Nat Commun, 2022）
图8 核定位的p85β调控肿瘤发生模型
（图源：Hao Y, et al., Nat Commun, 2022）
综上所述，该研究首次发现了在PIK3CA螺旋结构域突变的肿瘤中，p85β从PI3K复合体中解离，通过自身核定位信号进入细胞核，招募去泛素化酶USP7作用于EZH1/2，增强其蛋白稳定性，从而上调H3K27me3修饰水平，进而促进肿瘤发生（图8）。此外，针对PIK3CA螺旋结构域突变的肿瘤细胞，联合p110α抑制剂Alpelisib和EZH2抑制剂Tazemetostat能有效引发肿瘤消退，这为今后治疗含有PIK3CA螺旋结构域突变的病人提供了新的治疗策略。与此同时，作者即将开始一项联合Alpelisib和Tazemetostat治疗PIK3CA螺旋结构域突变病人的临床试验。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41467-022-29585-x
通讯作者王振和教授（前排中），共同第一作者李雅木（后排右二）
（照片提供自王振和实验室）
第一作者兼通讯作者郝宇钧教授（后排左三），共同第一作者何宝玉（后左二）
（照片提供自郝宇钧实验室）
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参考文献（上下滑动查看）
1. Samuels, Y., Wang, Z., Bardelli, A., Silliman, N., Ptak, J., Szabo, S., Yan, H., Gazdar, A., Powell, S.M., Riggins, G.J., et al. (2004). High Frequency of Mutations of the PIK3CA Gene in Human Cancers. Science 304, 554-554.
2 Hao, Y., Wang, C., Cao, B., Hirsch, Brett M., Song, J., Markowitz, Sanford D., Ewing, Rob M., Sedwick, D., Liu, L., Zheng, W., et al. (2013). Gain of Interaction with IRS1 by p110α-Helical Domain Mutants Is Crucial for Their Oncogenic Functions. Cancer Cell 23, 583-593.
3.Park, S.W., Zhou, Y., Lee, J., Lu, A., Sun, C., Chung, J., Ueki, K., and Ozcan, U. (2010). The regulatory subunits of PI3K, p85α and p85β, interact with XBP-1 and increase its nuclear translocation. Nature Medicine 16, 429-437.
4. Lee, J.E., Park, C.M., and Kim, J.H. (2020). USP7 deubiquitinates and stabilizes EZH2 in prostate cancer cells. Genetics and Molecular Biology 43.
制版︱王思珍
本文完