Cell Death Dis︱洪权教授课题组揭示IGFBP5在糖尿病肾脏病进展中的作用机制
撰文︱宋成成
责编︱王思珍
糖尿病肾脏病（diabetic kidney disease，DKD）一种慢性进展性疾病，是肾脏替代治疗的主要原因[1]。炎症反应是DKD的重要病理生理学特征，在DKD的发生和发展中起着至关重要的作用[2]。而DKD炎症反应的机制复杂，临床上可用于肾脏炎症的有效治疗方法很少。内皮活化是糖尿病的一个标志[3]，肾小球内皮细胞功能障碍出现较早，在DKD的发生和发展中起着关键作用[4,5]。
胰岛素样生长因子结合蛋白 5（insulin-like growth factor-binding protein 5，IGFBP5）是一种重要的分泌蛋白，属于IGFBP家族（IGFBP1～IGFBP7），其与多种组织中的炎症和纤维化有关[6-9]。研究发现IGFBP5在DKD中的表达显著上调。然而，IGFBP5在DKD中的功能及其机制尚不清楚。
2022年4月13日，解放军总医院的洪权教授课题组在Cell Death & Disease上发表了题为“IGFBP5 promotes diabetic kidney disease progression by enhancing PFKFB3-mediated endothelial glycolysis”的研究。该研究揭示IGFBP5通过诱导肾小球内皮细胞代谢重编程，增强内皮糖酵解，加重肾脏炎症反应，从而促进DKD进展，为研究IGFBP5在糖尿病肾脏病中的作用提供了新的见解，突出了IGFBP5有望成为抑制DKD炎症反应及延缓DKD进展的潜在靶点。
作者首先利用HUVEC与db/db肾组织，通过RT-qPCR和western blot检测了IGFBP5的表达，结果发现IGFBP5在高糖刺激（糖尿病状态）下表达上调（图1A-D），之后通过数据库检索发现在妊娠糖尿病患者的HUVEC中IGFBP5也呈现高表达（图1E）。为了研究IGFBP5在DKD中的作用，作者构建了IGFBP5过表达细胞系，通过体外细胞高糖刺激及siRNA细胞转染技术，利用qPCR证实IGFBP5-OE可促进内皮细胞ICAM-1, TNF-α, IL-6, and MCP-1升高（图1F-I）。接下来，作者将THP-1与HUVEC共培养，通过迁移实验观察IGFBP5-OE是否会影响单核细胞迁移。结果发现，与正常组相比，IGFBP5过表达（IGFBP5-OE）组显著促进单核细胞迁移（图1J, K）。这些结果表明IGFBP5可促进内皮细胞炎症因子表达及巨噬细胞迁移。
图1 IGFBP5在DKD小鼠表达增加并促进内皮炎症反应及单核细胞迁移
（图源：Song C, et al., Cell Death Dis, 2022）
接下来，作者使用IGFBP5基因敲除小鼠构建了糖尿病动物模型，通过RT-qPCR、组织病理染色及免疫荧光等技术，观察IGFBP5在糖尿病中的作用。PAS染色结果发现，与IGFBP5+/+-STZ鼠相比，IGFBP5+/+-STZ鼠肾脏病理损伤较重（图2F, G）；RT-qPCR结果示，与IGFBP5+/+-STZ鼠相比，IGFBP5+/+-STZ鼠炎症因子表达明显减少（图2H）；免疫荧光染色发现，IGFBP5+/+-STZ鼠较IGFBP5+/+-STZ鼠CD68（M1巨噬细胞）阳性数显著减少，而CD206（M2巨噬细胞）增加（图2I, J）。这些数据与体外实验结果一致，表明IGFBP5可增强DKD肾脏炎症反应及M1巨噬细胞浸润。
图2 IGFBP5敲除可减轻糖尿病肾脏病肾脏损害
（图源：Song C, et al., Cell Death Dis, 2022）
为了探究IGFBP5在DKD中的作用机制，作者使用IGFBP5-OE HUVEC行RNA-seq，分析下游信号通路的改变。结果发现，IGFBP5-OE可引起内皮细胞炎症及代谢相关信号通过上调，提示IGFBP5与内皮炎症及代谢改变有关（图3A, B）。越来越多的研究报道了6-磷酸果糖2-激酶/果糖2,6-二磷酸酶3（6-phosphofructose-2-kinase/ fructose-2,6-bisphosphatase 3，PFKFB3）在内皮细胞代谢中的关键作用[10-12]，作者之后检测了PFKFB3在高糖环境下的表达，结果发现PFKFB3在db/db鼠及高糖刺激后的细胞中表达显著上调（图3C, D）。作者根据RNA-seq测序结果及联合应用在线工具发现EGR1可能与PFKFB3启动子区结合（图3E-G）。之后通过RT-qPCR和western blot发现IGFBP5-OE可促进EGR1与PFKFB3表达升高（图3H-K）。最后作者通过染色体免疫共沉淀及双荧光素酶报告检测证实EGR1与PFKFB3启动子区结合促进后者转录（图3L, M）。
图3 IGFBP5通过促进PFKFB3与EGR1的结合增强PFKFB3表达
（图源：Song C, et al., Cell Death Dis, 2022）
接着，作者检测了不同条件下内皮细胞中乳酸、丙酮酸及F-2,6-BP的表达水平。结果发现，与正常对照组相比，IGFBP5-OE促进乳酸、丙酮酸及F-2,6-BP的合成增加，抑制IGFBP5/PFKFB3可降低三者的合成水平（图4A-F）。此外，作者还利用Seahorse技术测定了内皮细胞的细胞外酸化率（extracellular acidification rate，ECAR），以评估内皮细胞的糖酵解变化。结果发现，IGFBP5-OE可显著升高内皮细胞的ECAR水平，而抑制IGFBP5/PFKFB3则降低ECAR水平（图4G-N）。这些结果表明：IGFBP5通过PFKFB3调节内皮细胞糖酵解代谢。
图4 IGFBP5通过PFKFB3调节内皮细胞的糖酵解反应
（图源：Song C, et al., Cell Death Dis, 2022）
为了检测PFKFB3在内皮炎症中的作用，作者评估了内皮细胞中IL-6、TNF-α、ICAM-1和MCP-1的mRNA水平。结果显示，与对照组相比，抑制PFKFB3可降低上述炎症因子的mRNA表达水平，削弱IGFBP5-OE诱导的炎症反应（图5A, B）。相应地，作者还通过共培养研究了PFKFB3对单核细胞迁移的影响。结果显示，IGFBP5-OE显著增强THP-1细胞的迁移，并且这种作用在PFKFB3被抑制后所削弱（图5C, D）。这些数据表明：IGFBP5通过PFKFB3介导内皮细胞炎症反应。
图5 抑制PFKFB3表达可减轻内皮细胞炎症及单核细胞迁移
（图源：Song C, et al., Cell Death Dis, 2022）
接下来，作者使用了PFKFB3基因突变鼠构建糖尿病模型探究PFKFB3在DKD肾脏中的作用，通过组织病理染色、RT-qPCR及免疫荧光等技术等发现PFKFB3突变可减轻DKD小鼠肾脏病理损伤，减弱肾脏炎症反应，抑制M1巨噬细胞的浸润（图6A-E）。最后作者通过IGFBP5-OE慢病毒干预糖尿病小鼠，结果发现，PFKFB3突变可显著减轻IGFBP5-OE导致的肾脏病理损伤（图6F-I）。进一步说明IGFBP5通过PFKFB3在DKD中发挥作用。
图6 PFKFB3突变可减轻DKD小鼠肾脏病理改变
（图源：Song C, et al., Cell Death Dis, 2022）
最后，作者利用PFKFB3特异性抑制剂-3PO干预db/db小鼠体内PFKFB3的表达，观察PFKFB3药物性抑制是否有与PFKFB3突变类似的效果。结果发现，3PO可同样减轻DKD小鼠肾脏病理损伤，抑制肾脏炎症反应及M1巨噬细胞的浸润（图7），进一步证实PFKFB3在IGFBP5调控DKD肾脏炎症反应中的重要作用。
图7 特异性PFKFB3抑制剂3PO可减轻db/db小鼠肾脏损伤
（图源：Song C, et al., Cell Death Dis, 2022）
图8 文章总结图：IGFBP5通过增强PFKFB3介导的内皮糖酵解促进糖尿病肾脏病进展机制
（图源：Song C, et al., Cell Death Dis, 2022）
综上所述，该研究探讨了胰岛素样生长因子结合蛋白 5（IGFBP5）在糖尿病肾脏病（DKD）中的作用机制，并证实IGFBP5可增强DKD肾脏炎症反应。揭示IGFBP5主要通过增强转录因子EGR1表达，促进PFKFB3表达上调，诱导内皮细胞发生代谢重编程，促进炎症因子的产生及M1巨噬细胞的浸润（图8）。敲除IGFBP5或者PFKFB3突变可减轻DKD肾脏炎症反应。值得注意的是，目前尚未在细胞膜发现明确的IGFBP5特异性受体，高糖诱导IGFBP5升高的机制尚不清楚。此外，该研究缺乏相关临床资料的佐证，有待进一步完善和补充。总之，该研究首次证实了IGFBP5通过PFKFB3在DKD中发挥促炎作用，提示IGFBP5可能成为抑制DKD肾脏早期炎症反应及延缓DKD进展的潜在靶点。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s41419-022-04803-y
解放军总医院洪权教授与吴镝教授（现单位：北京电力医院）为论文的共同通讯作者，博士研究生宋成成为论文的第一作者。上述研究工作依托肾脏疾病国家重点实验室、国家慢性肾病临床医学中心完成，并得到了国家自然科学基金等资助。
通讯作者洪权教授（左）与吴镝教授（中），第一作者博士研究生宋成成（右）
（照片提供自：解放军总医院洪权课题组）
洪权 副研究员，博导，美国西奈山医院访问学者；从事代谢性肾脏疾病的发病机制的防治研究。研究成果以第一作者或通讯作者在J Am Soc Nephrol、Kidney Int和Cell Death & Dis等发表SCI论文30余篇，主译专著2部；是北京市科技新星。作为课题负责人承担国家自然科学基金4项、科技部重点研究项目国际间合作课题1项等。
吴镝 主任医师，教授，博导；从事慢性肾脏病疑难杂症的诊治与基础研究。以第一作者和通讯作者在Nat Comm、J Am Soc Nephrol等杂志发表SCI论文40余篇；是北京市科技新星；作为课题负责人承担科技部超级973子课题、863计划项目及国家自然科学基金面上项目等。
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制版︱王思珍
本文完