STAR Protocols︱刘涛课题组发展高效定点整合CAR-T细胞制备新方法
撰文︱凌鑫宇，常丽颖
责编︱王思珍
近年来，以CAR-T疗法为代表的细胞治疗发展迅速，在许多复发性及难治性癌症治疗中展现出非凡的疗效，已有多款临床CAR-T产品获批。然而目前在生产中，人们多采用逆转录病毒或慢病毒的方式将CAR基因导入T细胞中，由于CAR基因在T细胞中随机整合入基因组中，因此存在如转录沉默、细胞癌变等一系列风险。随着基因编辑技术的发展，基因组定点整合的CAR-T细胞作为一种更为安全、疗效稳定的疗法进入了人们的视线。但定点整合的CAR-T细胞制备效率较低，受到基因编辑效率与同源重组效率的双重限制，阻碍了其应用。
2022年3月29日，北京大学药学院刘涛课题组在Cell旗下的STAR Protocols杂志在线发表了题为“Efficient generation of locus-specific human CAR-T cells with CRISPR/cCas12a”的研究方案论文，利用其所开发的cCas12a基因编辑系统[1]进行了基因组定点整合的CAR-T细胞的高效制备。在此之前，刘涛课题组围绕基因编辑技术中存在的基因编辑效率低、同源重组效率低等一系列问题，结合基因密码子扩展技术与基因编辑技术，已在Science Advances、Molecular Cell、Chemical Communications上发表多篇高水平工作[1-3]，助力了基因编辑技术的发展。
与常用的Cas9基因编辑系统相比，Cas12a系统由于其脱靶率低、精准性更高的特点备受关注。然而由于Cas12a系统的基因编辑效率较低，严重限制了其应用。在之前的工作中，作者利用基因密码子扩展技术得到了定点修饰叠氮基团的CRISPR/Cas12a蛋白，并与末端修饰DBCO的crRNA完全偶连，制备得到了共价的核糖核蛋白复合物（conjugated Cas12a，cCas12a），极大地提高了Cas12a系统的基因组编辑效率。
在这一工作中，作者详细阐述了利用cCas12a系统制备定点整合CAR-T细胞的实验方案（图1）。作者选择了TRAC基因座作为插入位点，利用基因密码子扩展技术，将含有叠氮基团的非天然氨基酸AeF、AzF、NAEK等引入蛋白的806位点，进而通过生物正交反应在体外制备TRAC靶向的cCas12a复合物。作者通过电转的方式将TRAC-cCas12a导入T细胞中，之后以AAV6为载体将含有CAR基因的同源重组片段递送至T细胞内，利用同源重组的方法将CAR基因定点整合至TRAC基因座中，得到定点整合的CAR-T细胞。
图1 利用cCas12a系统制备定点整合CAR-T细胞的实验方案
（图源：Ling X et al., STAR Protoc, 2022）
作者分别对CAR基因定点整合的T细胞进行了流式分析与基因组插入分析。通过该方案，CAR-T细胞的制备效率可提升至50%以上。通过LDH检测与细胞因子检测，所制备的CAR-T细胞具备良好的免疫学功能（图2,3）。在此方案中，作者联合基因密码子扩展技术与生物正交反应，提出了定点整合的新一代CAR-T细胞的高效制备方案，为CAR-T细胞为代表的细胞疗法领域注入了新的活力，进一步促进了该疗法的发展与应用。
图1 CAR-T细胞制备效率的流式分析
（图源：Ling X et al., STAR Protoc, 2022）
图2 CAR-T细胞的免疫学效应评价
（图源：Ling X et al., STAR Protoc, 2022）
原文链接：https://star-protocols.cell.com/protocols/1574
常丽颖（左一），刘涛（中），凌鑫宇（右一）。
（照片提供自：北京大学药学院刘涛实验室）
北京大学博士生凌鑫宇和博士生常丽颖为该工作的共同第一作者，北京大学药学院刘涛研究员为该工作的通讯作者。该工作获得了北京市自然科学基金项目（JQ20034）、国家自然科学基金（91853111, 21778005和21922701）、国家重大新药创制专项（2019ZX09739001）、深圳市合成生物学研究所科研计划（DWKF20190004）、临床医学+ X青年学者计划（PKU2020LCXQ029）、北京大学医学部优秀博士研究生创新基金（71006Y2460）的资助。
刘涛研究员
（照片提供自：北京大学药学院刘涛实验室）
刘涛，北京大学药学院特聘研究员，博士生导师，分子与细胞药理学系主任，天然药物及仿生药物国家重点实验室独立PI。中组部海外高层次青年人才，国家优青，北京市杰青获得者。在Nat Chem Biol、Molecular Cell、Science Advances、J Am Chem Soc、Angewandte Chemie、Cell Chem Biol等国际顶级期刊发表科研论文30余篇。团队研究方向包括生物技术在生物药物研发以及疾病机理解析中的应用。发展了含有人造氨基酸的蛋白创新药物，应用在肿瘤及基因治疗等多种领域，从而促进了生物药物的升级换代。
【1】Sci Adv︱臧星星团队首次发现免疫检查点B7-H3是代谢和肥胖的调节分子
【2】Cell︱潘荣清等报道通过靶向线粒体凋亡来增强免疫疗法的一种新策略
【3】Sci Adv︱欧阳苑等发现导致急性髓细胞白血病发生的重要事件：MSN R295C基因突变
【4】Cell Death Dis︱聂庆华/张细权团队揭示lncRNA与蛋白质互作调控家禽骨骼肌发育的新机制
【5】Front Cell Dev Biol︱周波课题组揭示影响断奶仔猪混群后攻击行为的分子机制
【6】Sci Signaling︱郭斐/梁臣/岑山团队合作发现SARS-CoV-2诱导的细胞-细胞融合激活cGAS-STING通路
【7】Nat Commun︱王振和/郝宇钧团队发现肿瘤发生新机制：核定位的p85β增强PIK3CA螺旋结构域突变细胞的肿瘤发生
【9】Cell Death Dis︱洪权教授课题组揭示IGFBP5在糖尿病肾脏病进展中的作用机制
【0】Science︱赵祥等揭示逆锁键工程可以调节T细胞受体的信号强度且不引入脱靶毒性，有望应用于TCR-T肿瘤免疫细胞治疗
参考文献（上下滑动查看）
1.Ling, X., et al., Improving the efficiency of CRISPR-Cas12a-based genome editing with site-specific covalent Cas12a-crRNA conjugates. Molecular Cell, 2021. 81(22): p. 4747-4756.e7.
2.Ling, X., et al., Rational design of minimum CRISPR guide RNA by site-specific Cas9–RNA conjugation. Chemical Communications, 2020. 56(54): p. 7515-7518.
3.Ling, X., et al., Improving the efficiency of precise genome editing with site-specific Cas9-oligonucleotide conjugates. Science Advances. 6(15): p. eaaz0051.
制版︱王思珍
本文完