Cell Death Differ︱秦仁义团队发现去泛素化酶USP14有望成为治疗胰腺癌的新靶点

撰文︱赵春乐，巩军

责编︱方以一，王思珍

编辑︱方以一

胰腺导管腺癌（Pancreatic Ductal Adenocarcinoma，PDAC）是最致命的实体恶性肿瘤之一[1]。尽管近年来对PDAC的诊断和治疗策略有所改善，但5年生存率仍然低于10%[2]，预后极差。尽管近年来对胰腺癌发病机制的研究已经取得了部分进展，并且已经发现了多种药物靶点，但大多数潜在的“治疗靶点”在临床上并不可行。因此，探索PDAC的新药物靶点并且据此进行新药研发对于延长胰腺癌患者的生存期至关重要。

2022年7月29日，华中科技大学同济医学院附属同济医院胆胰外科秦仁义教授团队在Cell Death & Differentiation上发表了题为“A self-amplifying USP14-TAZ loop drives the progression and liver metastasis of pancreatic ductal adenocarcinoma”的研究。该研究基于去泛素化酶库筛选发现USP14是调控胰腺癌中致癌基因TAZ的关键去泛素化酶，阐明了USP14和TAZ之间的正反馈调控机制，为靶向治疗胰腺癌提供了新分子靶点，并且在皮下异种移植模型和肝转移模型中发现USP14抑制剂IU1能够抑制PDAC的进展，为胰腺癌的靶向治疗提供理论依据。

首先，作者通过GEO数据库分析发现胰腺癌中Hippo信号通路失调，且与胰腺癌发展正相关（P<0.05）（图1A）。随后，作者通过PDAC组织芯片、GEO数据库和TCGA数据库进一步发现Hippo信号通路关键基因TAZ在肿瘤组织中显著高表达并且与患者较差的预后相关（图1B-D）。这些数据表明TAZ作为一个癌基因在胰腺癌中发挥作用。由于缺乏已知的催化活性，药理学抑制TAZ极其困难，因此作者通过筛选调节TAZ功能的去泛素化酶寻找靶向TAZ的替代策略。为此，作者在胰腺癌细胞系中分别过表达81种人源去泛素化酶，通过8×GTIIC荧光素酶报告基因活性检测，并通过Western Blot实验检测TAZ的蛋白水平，发现USP14可以调节Hippo信号通路并且稳定TAZ的蛋白水平（图1E-H）。作者还检测了Hippo信号通路的其他关键蛋白，进一步证明USP14在转录后水平影响TAZ及其下游蛋白的变化，但是不影响TAZ上游以及YAP的蛋白水平（图1I-L）。

图1 DUB库筛选发现USP14是Hippo信号通路的关键调控基因

（图源：Zhao CL, et al., Cell Death & Differentiation, 2022）

为了研究USP14导致TAZ蛋白表达升高的机制，作者通过Co-IP实验、GST pull down实验和免疫荧光实验表明USP14和TAZ之间存在直接相互作用（图2A-E）。考虑到USP14具有去泛素化酶活性，作者构建USP14酶活性失活的USP14^C114A质粒，发现酶活性失活的USP14不能稳定TAZ的蛋白表达（图2F）。此外，作者发现MG132抑制了敲低USP14导致的TAZ蛋白表达降低，并且USP14可以抑制TAZ蛋白降解的半衰期（图2G-I）。因此，作者证明了USP14和TAZ相互作用并以去泛素化酶活性依赖的方式稳定TAZ表达。

图2 USP14与TAZ相互作用并以去泛素化酶活性依赖的方式稳定TAZ表达

（图源：Zhao CL, et al., Cell Death & Differentiation, 2022）

为了明确USP14介导的TAZ蛋白稳定是否由去泛素化途径介导，作者进行外源性和内源性的泛素化实验。结果表明， USP14能够显著降低TAZ的泛素化水平，而USP14^C114A突变体则不能（图3A-F）。为了确定USP14影响的TAZ多聚泛素链的类型，在存在或不存在USP14-HA或USP14^C114A-HA的情况下，用TAZ-Flag与Ub-Myc-WT、Ub-Myc-K48O（仅限Lys48 残基完整的泛素）、Ub-Myc-K63O（仅限 Lys63 残基完整的泛素）共转染HEK293T细胞。泛素化实验结果表明，USP14显著降低了TAZ的K48多聚泛素链，但不影响K63多聚泛素链（图3G-H）。

图3 USP14通过去除TAZ K48位的泛素化链稳定TAZ 

（图源：Zhao CL, et al., Cell Death & Differentiation, 2022）

鉴于USP14在调节TAZ蛋白稳定性中的重要作用，以及Hippo信号通路和TAZ在人类肿瘤发生中的功能，作者评估了USP14在胰腺癌中的生物学作用。首先作者构建了稳定过表达以及敲低USP14的胰腺癌细胞系，然后通过体内外实验检测USP14对胰腺癌细胞增殖能力的影响，结果表明， USP14能够显著促进胰腺癌细胞的增殖能力以及小鼠皮下瘤的生长（图4）。

图4 USP14促进胰腺癌细胞的增殖 

（图源：Zhao CL, et al., Cell Death & Differentiation, 2022）

此外，作者通过Tranwell实验以及脾脏注射胰腺癌细胞建立肝转移模型检测USP14对胰腺癌细胞侵袭转移能力的影响。结果表明，敲低USP14抑制胰腺癌细胞的侵袭转移能力，减少了肝脏微转移结节的数量以及平均斑点的面积，延长小鼠的总生存时间；而USP14的过表达促进胰腺癌细胞的侵袭转移能力，导致肝转移结节数量显著增加，并减少了小鼠的总生存时间（图5）。

图5 USP14促进胰腺癌细胞的侵袭转移能力

（图源：Zhao CL, et al., Cell Death & Differentiation, 2022）

以上研究结果表明，USP14可以通过去泛素化途径稳定TAZ蛋白的表达，并且体内和体外实验均表明USP14促进胰腺癌细胞增殖和侵袭转移的能力。因此，作者进一步探索USP14促进胰腺癌细胞增殖和侵袭转移的过程是否依赖于TAZ发挥作用。通过体内外实验，作者发现，沉默TAZ抑制了过表达USP14所导致的肿瘤生长速度的增加，TAZ沉默组肝脏微转移结节数量和病灶大小显著减少（图6）。

图6 USP14以TAZ依赖的方式促进胰腺癌细胞的增殖和侵袭转移能力

（图源：Zhao CL, et al., Cell Death & Differentiation, 2022）

随后，作者探索了 USP14 的表达在胰腺癌中的意义。通过分析GEO数据库，TCGA数据库，检测胰腺癌组织以及胰腺癌细胞系中USP14的表达，作者发现，USP14 在胰腺癌中高表达并且和不良预后显著相关（图7A-I）。此外，作者对胰腺癌组织芯片分别进行TAZ和USP14免疫组化染色，并且对每个组织的染色结果进行评分，发现在胰腺癌样本中USP14 和 TAZ 丰度之间存在显著正相关（图7J）。

图7 USP14在胰腺癌中显著高表达

（图源：Zhao CL, et al., Cell Death & Differentiation, 2022）

在胰腺癌细胞系中沉默TAZ的逆转实验中，作者发现沉默TAZ可以降低USP14的蛋白表达水平，提示USP14可能受TAZ调控。随后，作者在过表达或者激活TAZ的胰腺癌细胞中检测发现，TAZ可以促进USP14蛋白和mRNA的表达（图8A-D）。并且，通过双荧光素报告基因实验以及Chip-qPCR实验，表明TAZ可以与USP14的启动子区域进行结合，进而促进USP14的转录（图8E-G）。

图8 TAZ在转录水平促进USP14的表达

（图源：Zhao CL, et al., Cell Death & Differentiation, 2022）

综上述研究，作者阐明了USP14在胰腺癌进展和肝转移中的作用及潜在机制。随后，作者评估了USP14特异性抑制剂IU1在胰腺癌模型中的潜在治疗效果。结果表明，IU１可以显著的抑制胰腺癌细胞的增殖和侵袭转移能力、抑制皮下瘤的生长速度、降低肝脏微转移结节的数量和病灶的大小、延长小鼠总生存时间（图9）。

图9 USP14 作为治疗靶点的临床转化研究

（图源：Zhao CL, et al., Cell Death & Differentiation, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

胰腺导管腺癌（PDAC）被认为是癌症相关死亡率的第四大原因[1]。尽管近几十年来，人们在可视化生物分子结构和开发新的靶向治疗方案方面做出了大量努力[3,4]，但仍需要开发新的治疗靶点。Hippo通路与许多人类癌症密切相关，靶向该通路的成分是一种新的癌症治疗策略[5-7]。然而，针对Hippo通路进行癌症治疗的小分子药物的开发在技术上仍然具有挑战性。本文中重点研究了去泛素化酶，因为对其进行药理靶向可能是解决底物不可药性的一种替代策略。在本研究中，作者发现在PDAC中TAZ作为致癌基因被激活。通过无偏倚的功能获得性筛选，作者确定USP14是调控TAZ泛素化和稳定性的最有效去泛素化酶。体外和体内功能实验证实，USP14是PDAC中癌症进展和肝转移的驱动因素。此外，TAZ/TEADs在转录水平正向调控USP14的表达，表明USP14与TAZ形成正反馈回路，促进PDAC的进展。此外，作者还发现，USP14特异性抑制剂IU1可以抑制小鼠PDAC模型进展和肝转移。IU1可能成为治疗胰腺癌靶向药物的先导化合物。值得注意的是，USP14与蛋白酶体相关，在调节蛋白质降解中发挥重要作用[8]。然而，USP14作为蛋白酶体的组成成分，同时可以以非特异性的方式靶向许多其他底物。因此，USP14在胰腺癌中的调节机制还有待进一步探索。

论文链接：https://www.nature.com/articles/s41418-022-01040-w

通讯作者：秦仁义

（照片提供自：华中科技大学同济医学院附属同济医院胆胰外科实验室）

通讯作者简介：（上下滑动阅读）  

秦仁义，国家二级教授，主任医师，博士，博士后，博士研究生、博士后导师。同济医院手术总监部主任，同济医院肝胆胰研究所副所长，胆胰外科中心主任。胆道、胰腺外科学术带头人。国家自然科学基金评审专家，教育部留学回国人员科研启动基金评审专家，教育部科技奖励评审专家、国家科技成果奖评审专家。国际肝胆胰协会委员，国际腹腔镜外科医师学会委员（SLS）、美国外科医师学会委员(FACS)、中国医药教育协会腹部肿瘤专业委员会副主委、中国研究型医院学会胰腺病专业委员会副主委、胰腺疾病微创治疗学组副组长、中国医疗保健国际交流促进会胰腺疾病分会常委、胰腺疾病微创治疗学组组长、中国抗癌协会胰腺专业委员会副主任委员、 胰腺微创学组副组长、中华医学会外科学分会胰腺外科学组委员、中国胰腺病学会理事、湖北省临床肿瘤（协）会胆胰肿瘤分会主委，湖北省医学会普外学会常务委员、湖北省胰腺病分会副主委，湖北省胰腺外科临床医学研究中心主任，武汉市抗癌研究会会长。

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本文完