Acta Neuropathol︱翻转酶ATP11B异质表达缺失导致脑小血管疾病

岚翰生命科学 2023-03-10

The following article is from 赛业生物订阅号 Author 小赛

来源︱“ 赛业生物订阅号”

编辑︱方以一

脑小血管病（Small Vessel Disease，SVD）在医学界常常被称为“小卒中”，尽管症状小，但危害大，因此近年来逐渐受到重视。脑小血管病是血管性痴呆的主要原因，与临床上四分之一的卒中有关，还会导致运动障碍和情感障碍。然而，该疾病的临床表现往往是隐蔽的，患病个体和临床医生都没有充分认识到。

通常认为，脑小血管病的风险随着年龄的增长而增加，并且与高血压、糖尿病和高胆固醇血症相关。尽管高血压一直被认为是该疾病的危险因素，但大约30%的散发患者并没有高血压病史，而且这也无法解释该病的斑块性质以及与内皮细胞功能障碍之间的关联。

为此，来自爱丁堡大学的科研人员构建了一种在维持正常血压的情况下却患有脑小血管病的基因编辑大鼠模型，证明了磷脂翻转酶ATP11B缺失导致内皮细胞功能障碍，继而引起脑小血管病，即使在没有高血压的情况下也会发生。该研究于近日以“Loss of the heterogeneous expression of flippase ATP11B leads to cerebral small vessel disease in a normotensive rat model”为题发表在Acta Neuropathologica杂志上，有望为脑小血管病的治疗提供新的策略。

一、研究材料

本项研究主要使用了由赛业生物构建的血压正常的ATP11B缺失的Atp11b KO大鼠模型。

二、技术方法

本项研究主要采用了免疫荧光、电镜观察和磁共振成像等病理学和影像学研究技术，以及步态分析、新物体识别和迷宫实验等行为学研究方法。

三、技术路线

1、评估磷脂翻转酶ATP11B在多种脑细胞中的表达

2、构建Atp11b KO大鼠，系统敲除大鼠的Atp11b基因

3、评估Atp11b KO大鼠的内皮细胞是否存在功能障碍

4、通过MRI观察Atp11b KO大鼠脑部的影像学变化

5、通过多项行为学测试分析Atp11b KO大鼠的行为特征变化

四、研究结果

1、构建ATP11B缺失的脑小血管病大鼠模型

脑小血管病在影像学上表现为腔隙综合征、脑白质病变以及微出血等多种脑组织损伤。白质变化与血管疾病之间的关联可能在于血脑屏障的内皮细胞（EC）。研究人员之前在自发性高血压大鼠模型中的相关研究数据表明磷脂翻转酶ATP11B的缺失可能与内皮细胞功能障碍之间存在关联。

在这项研究中，研究人员从ATP11B着手开展深入分析，通过检测发现，内皮细胞、神经胶质细胞和神经元均表达ATP11B，但均以异质性方式表达。胶体金免疫电镜的观察结果也证实，ATP11B蛋白在内皮细胞中的表达呈现明显异质性，在同一血管的同一横切面中的表达也呈现异质性。

为了研究在血压正常的情况该疾病的病理学，作者与赛业生物合作。赛业生物利用CRISPR-Cas9技术系统敲除了Atp11b基因中5号外显子至8号外显子之间的序列，导致ATP11B蛋白无表达，成功构建ATP11B缺失的Atp11b KO基因编辑大鼠模型（图1）。与野生型对照大鼠相比，Atp11b KO大鼠无明显的健康问题，并且血压正常。接下来，作者进一步研究了在正常血压且ATP11B缺失的情况下，幼年大鼠和成年大鼠是否仍会出现内皮细胞功能障碍。

图1 Atp11b KO基因编辑大鼠的构建策略及不同对照组的血压数据

（图源：Quick, S., et al., Acta Neuropathol, 2022）

2、Atp11b KO大鼠表现出与SVD相似的变化

内皮细胞功能障碍可通过几种分子特征来定义，包括内皮型一氧化氮合成酶eNOS的丧失、紧密接连跨膜蛋白CLDN5的减少以及内皮激活标志物ICAM-1的上调。研究人员发现，Atp11b KO幼年大鼠脑部的CLDN5⁺血管显著减少，内皮细胞增殖增加。成年大鼠的CLDN5⁺血管的减少程度和ICAM-1的表达上调幅度更大。

同时，视网膜成像分析表明，幼年KO大鼠的视网膜动脉直径减少，成年大鼠的动脉直径和曲折度减少，但神经丛血管分支增加，这些与脑小血管病的特征相关。以上结果表明，KO大鼠的异常与高血压无关。以上数据表明，尽管不存在高血压，但Atp11b KO大鼠的内皮细胞仍表现出功能障碍的分子特征。

接下来，研究人员分析了ATP11B缺失是否影响了白质变化。通过分析KO大鼠血管周围10µm环内髓鞘碎片与空泡的百分比，作者发现髓鞘组织的破坏增加，但不同血管之间存在差异，这可能取决于内皮细胞中ATP11B表达的异质性。这些结果支持了之前的假设：内皮细胞的变化驱动了血管周围的白质变化。后续分析证实，Atp11b KO大鼠小血管周围的白质损伤呈斑片状，与其内皮功能障碍有关。

之后，作者继续采用磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging, MRI）评估了大鼠的脑部特征，这也是人类脑小血管病的诊断方式。与野生型对照相比，所有KO大鼠在晚年都有脑室扩大。正如预期的那样，脑室扩大与组织体积的减少有关，表明存在神经退行性病变，并且与脑小血管病中的脑萎缩和脑室扩大一致（图2）。此外，KO大鼠也存在微出血的MR证据，与人类患者一致。

图2 Atp11b KO大鼠表现出与SVD相似的MR

（图源：Quick, S., et al., Acta Neuropathol, 2022）

那么，这些影像和病理变化如何影响大鼠的行为？作者通过进一步的行为学实验发现，与脑小血管病的患者相似，KO大鼠的步态和认知都存在问题，随着年龄的增长记忆力也较差。此外，在高架十字迷宫中，KO大鼠的总体移动距离明显更短，也反映出KO大鼠存在移动和认知上的问题。

总结

这项研究表明，Atp11b KO大鼠在没有高血压的情况下出现内皮细胞功能障碍、脑白质病变和影像学变化，以及与脑小血管病患者相似的行为特征。这些结果推翻了散发性脑小血管病依赖高血压的传统观点，使人们的注意力重新集中在内皮细胞功能障碍上，这有望为脑小血管病及痴呆症的治疗带来新策略。

原文链接： https://doi.org/10.1007/s00401-022-02441-4

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