Redox Biol︱吴希美/邹朝春团队合作发现维生素C缺乏导致幼雌鼠发生低血糖并揭示其中相关分子机制

撰文︱舒颖颖

责编︱王思珍，方以一

编辑︱方以一

维生素C（vitamin C，VC）是机体内最重要的抗氧化剂，它可清除氧化型自由基，并阻止其它氧化剂的氧化[1]。近几年的研究表明，VC在调控机体糖代谢和脂质代谢方面发挥了重要的作用[2, 3]。但是，目前针对VC介导的能量代谢研究主要局限于糖尿病等病理条件下，而缺少VC缺乏条件下血糖的变化及其相关分子机制的研究[2, 4]。因此，深入认识并阐明VC缺乏条件下机体血糖的变化及其相关分子机制将为临床低血糖患者的预防和诊治提供一定的指导。

2022年8月8日，浙江大学基础医学院吴希美教授、浙江大学附属儿童医院邹朝春教授/舒颖颖博士合作在Redox Biology上发表了题为“Vitamin C deficiency induces hypoglycemia and cognitive disorder through S-nitrosylation-mediated activation of glycogen synthase kinase 3β”的研究。该研究基于动物模型构建、原代细胞培养、蛋白质组学测序等方法首次发现了VC缺乏特异性引起幼雌鼠发生低血糖并导致认知功能障碍，并揭示其中相关的分子机制，为临床上低血糖患儿的预防和诊治提供了理论依据。

VC是一类小分子量的水溶性多羟基化合物。自然界中，除人类、灵长类、豚鼠、蝙蝠、鱼类和鸟类外，其余物种均可自主合成VC。在人类进化的过程中，由于编码催化VC合成的最后一步限速酶，即L-古洛糖-1,4-内酯氧化酶的基因（Gulo）发生失活突变，导致人类自身无法合成VC，只能从外界摄取[5]。

为了探究VC缺乏与血糖变化之间的关系，研究者选用Gulo基因敲除的小鼠作为模式生物。该小鼠自主合成VC能力丧失，因此可以更好地排除小鼠内源性基础水平VC的影响，更接近人体内VC的代谢情况。研究者所在团队的前期研究中已证明，缺少外源性VC补充的Gulo-/-小鼠血清中的VC浓度较野生型小鼠降低85%，仅剩14.2 μM左右；在小鼠饮水中添加3.3 g/L的VC后，Gulo-/-小鼠体内的VC恢复至正常生理浓度60 μM，可维持其正常的生长和发育[2, 4]。另外，一般的观点认为，根据人类与小鼠的生命周期比对，6周龄的小鼠相当于人类的青春期，10周龄的小鼠相当于人类的成年期，3-8周龄的小鼠相当于人类的儿童期和青春期[6]。研究者在前期工作中发现缺少外源性VC补充达5周及以上的的Gulo-/-小鼠，其生存状态受到显著影响，甚至发生死亡。综上，研究者以3周龄小鼠为起始模型，通过在Gulo-/-小鼠饮水中补充或不补充外源性VC设置VC缺乏实验组与对照组，观察时间持续5周，以探究VC缺乏对儿童期和青春期（出生后3周至8周）的Gulo-/-雌雄小鼠糖代谢的影响。

通过血糖仪监测各组小鼠在VC处理前后每周的空腹血糖，研究者发现：Gulo-/-雌鼠的空腹血糖在VC缺乏3-5周时均显著降低，且空腹血糖AUC在VC缺乏2-5周期间下降约22%（图1a）。进一步通过蛋白质组学分析：VC缺乏3周后 Gulo-/-雌鼠肝脏组织中肝脏型糖原磷酸化酶（liver glycogen phosphorylase，PYGL）表达下调（图1b）。接下来，通过蛋白质免疫印迹和免疫组化的方法，研究者证实了VC缺乏3周显著促进了Gulo-/-雌鼠餐后状态下肝脏组织中p-Ser641-GS的表达（图1c, d），并抑制了空腹状态下肝脏组织中p-Ser15-PYGL的表达（图1e, f）。这些数据表明：VC缺乏引起Gulo-/-雌鼠的空腹血糖降低，且这种作用可能通过影响肝糖原的合成与分解得以实现。

图1 VC缺乏通过影响肝糖原的合成与分解降低Gulo-/-雌鼠的空腹血糖

（图源：Shu Y, et al., Redox Biol, 2022）

由于糖原合成酶激酶3β（GSK3β）是调控糖原合成酶的重要上游分子，当其Ser9位点发生去磷酸化时会被激活，激活后的GSK3β可通过磷酸化GS2而抑制其活性，从而负向调控糖原的合成[7, 8]，于是研究者先对VC缺乏是否影响GSK3β的活性进行了探索：首先，小鼠肝脏组织的免疫组化结果表明，与对照组相比，VC缺乏3周组的Gulo-/-雌鼠肝脏组织中p-Ser9-GSK3β表达显著减少（图2a）。为了进一步验证该结果，研究者采用胶原酶灌注法提取了VC缺乏3周的Gulo-/-雌鼠的原代肝细胞，并在体外用生理浓度，即60 μM的VC刺激，结果表明，在体外用60 μM的VC刺激可时间依赖性地促进VC缺乏3周的Gulo-/-雌鼠原代肝细胞中GSK3β的Ser9位点的磷酸化（图2b）。通过免疫沉降Gulo-/-雌鼠肝脏组织中的GSK3β蛋白并采用iodoTMT标记的方法检测S亚硝基化修饰的GSK3β蛋白（SNO-GSKβ）后，研究者发现，与对照组相比，实验组（VC缺乏3周）的Gulo-/-雌鼠肝脏组织中的GSK3β的S亚硝基化水平显著增加（图2c）。为了进一步验证上述体内实验的结果，研究者在HepG2细胞上转染了带Flag标签的野生型GSK3β质粒，并作了相应的加药处理：先用5 nM的N6022处理30 min，再用60 μM的VC处理30 min，通过免疫沉降Flag-GSK3β蛋白并对其进行S亚硝基化检测分析后，发现与对照组相比，N6022处理可显著促进Flag-GSK3β的S亚硝基化，而VC可起到挽救作用，即抑制N6022所引起的Flag-GSK3β的S亚硝基化水平的增加（图2d）。这部分结果已证实：VC缺乏促进了GSK3β的S亚硝基化。

图2 VC缺乏通过促进GSK3β的Cys14的S亚硝基化而增强其活性

（图源：Shu Y, et al., Redox Biol, 2022）

接下来研究者将通过一系列体内外实验继续深入探究VC缺乏影响GSK3β发生S亚硝基化的具体位点。首先，根据GPS-SNO 1.0软件预测，Cys14是GSK3β分子中最可能发生S亚硝基化的位点。根据Uniprot和NCBI数据库，对比人和小鼠的GSK3β蛋白序列并进行同源分析，发现包括Cys14在内的前20个氨基酸在人和小鼠的GSK3β蛋白中高度同源（图2e）。为了进一步验证上述猜想，研究者构建了带Flag标签的野生型（wild-type, WT）和C14S突变型的人源GSK3β质粒，并在HepG2细胞上分别转染上述两种质粒，再分别用VC或N6022处理，通过免疫沉降Flag-GSK3β蛋白后检测Flag-p-GSK3β的表达。结果表明：转染WT的GSK3β质粒后，用60 μM的VC处理可显著增加Flag-p-GSK3β的表达，但该作用在转染C14S突变型的GSK3β质粒后消失（图1f）。在HepG2细胞上分别转染WT和C14S突变型的GSK3β质粒后，再用N6022处理，免疫沉降Flag-GSK3β蛋白后用iodoTMT标记的方法检测Flag-SNO-GSK3β的水平。结果表明：用N6022处理转染WT的GSK3β的HepG2细胞后，Flag-SNO-GSK3β的表达水平显著增加，而转染C14S突变型的GSK3β的HepG2细胞中的Flag-SNO-GSK3β表达水平没有变化，并且转染C14S突变型的Flag-SNO-GSK3β表达水平较WT低，而其Flag-p-GSK3β表达水平较WT高（图1g）。此外，通过分子动力学模拟，研究者发现在野生型的GSK3β蛋白中，由于其Ser9的羟基裸露在外，容易被磷酸化而失活；当其Cys14发生S亚硝基化后，通过20 ns的分子动力学模拟，可看到Ser9转入内部并与残基Lys91之间形成氢键（2.1 Å），从而阻止了Ser9被磷酸化，并因此促进了GSK3β的激酶活性（图1h）。这些数据表明：VC缺乏引起Gulo-/-雌鼠的空腹血糖降低，且这种作用可能通过影响肝糖原的合成与分解得以实现。这些数据表明：VC缺乏通过促进GSK3β的Cys14的S亚硝基化而增强其活性。    

已有研究报道儿童期发生的低血糖会严重影响学习记忆能力，接下来研究者着重探究VC缺乏所引起的低血糖是否对小鼠的认知功能产生影响。首先，研究者将18只出生后3周的Gulo-/-雌鼠随机分为三组，即VC补充组（VC+/Vehicle）、VC缺乏组（VC-/Vehicle）和葡萄糖补充组（VC-/Gluose），并给予相应的VC或葡萄糖处理，连续每周监测处理前后各组小鼠的空腹血糖和体重变化，相应处理3周后利用Morris水迷宫试验评估小鼠的学习记忆能力，发现：与VC补充组的小鼠相比，VC缺乏组的小鼠找到平台的潜伏期增加（图3a），穿越平台次数减少（图3b），平均游泳速度降低（图3c），平均游泳距离减少（图3d），目标象限滞留时间百分比减少（图3e），但这些指标在葡萄糖补充组的小鼠中均得到了部分改善。以上这些数据表明，VC缺乏引起的低血糖可导致认知功能障碍，而补充葡萄糖可挽救部分认知功能。

图3 补充葡萄糖或L-NAME可部分改善VC缺乏引起的低血糖导致的小鼠认知功能障碍

（图源：Shu Y, et al., Redox Biol, 2022）

为了进一步验证VC缺乏所引起的低血糖和认知功能障碍与GSK3β的S亚硝基化之间的关系，研究者又进行了L-NAME挽救实验：将18只出生后3周的Gulo-/-雌鼠随机分为三组，即VC补充组（VC+/Vehicle）、VC缺乏组（VC-/Vehicle）和L-NAME补充组（VC-/L-NAME），并给予相应的VC或L-NAME处理，连续每周监测处理前后各组小鼠的空腹血糖和体重变化，相应处理3周后利用Morris水迷宫试验评估小鼠的学习记忆能力，发现：与VC缺乏组的小鼠相比，潜伏期和穿越平台次数在L-NAME补充组的小鼠中均得到了部分改善（图3f, g），尽管平均游泳速度、游泳距离和目标象限滞留时间百分比两组小鼠间无显著差异。研究者推测造成上述差异的原因可能是葡萄糖除了可改善小鼠的血糖外，还可直接提供能量，从而改善小鼠的运动能力，但L-NAME仅通过改善小鼠的血糖从而改善其学习记忆能力。这些数据表明：VC缺乏引起的低血糖导致小鼠发生认知功能障碍，而补充葡萄糖或L-NAME可部分改善小鼠的认知功能障碍。  

图4 模式图：维生素C缺乏导致幼雌鼠发生低血糖

（图源：Shu Y, et al., Redox Biol, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，上述研究主要从动物和细胞两个层面就维生素C（VC）缺乏对机体糖代谢产生的影响及其相关分子机制进行了探究（模式图见图4），发现：VC缺乏通过诱导GSK3β的S亚硝基化，而促进其对GS2 的磷酸化，引起GS2失活。GS2的失活会抑制餐后状态下肝糖原的合成，导致肝糖原储备不足，储备不足容易造成耗竭，最终引起低血糖。此外，VC缺乏通过抑制PYGL的活性而减少空腹条件下肝糖原的分解，提示VC可能也参与对肝糖原分解过程的调控。VC缺乏所引起的低血糖现象导致小鼠学习记忆能力减退，该症状可通过补充葡萄糖或L-NAME得到部分缓解。上述结果强调了VC在糖代谢中的作用，提示及时补充VC对VC缺乏的幼雌鼠血糖的稳定和学习记忆能力的提升具有重要意义。值得注意的是，上述研究仅发现VC缺乏通过抑制PYGL的活性而减少空腹条件下肝糖原的分解，但对于其中的相关具体分子机制还有待进一步研究。

原文链接：https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2213231722001926

通讯作者：吴希美（左）、邹朝春（右）

（照片提供自：WU-Lab）

作者简介（上下滑动阅读） 

吴希美：浙江大学医学院国外引进的教育部985工程的教授和博导，负责多个国家自然科学基金项目和国家基础研究重点项目973项目的子课题，在多年的研究中取得了较为卓越的成绩，分别以第一和第二作者的身份在《Cell》和《Nature Medicine》杂志发表了研究论文，另外在《Cell Death Differentaion》、《Endocrinology》等著名国际期刊上发表论文。

邹朝春：担任中华医学会儿科学分会罕见病学组副组长，长期从事儿童内分泌代谢和遗传性疾病的临床、科研和教学工作。已主持和参与各类科研项目20余项，包括主持国家自然科学基金3项、浙江省自然科学基金杰青1项。共发表论文120余篇，发表第一或通讯作者的SCI收录的论文30余篇。舒颖颖：浙江大学医学院儿科学2022届毕业博士生。

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参考文献（上下滑动阅读） 

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本文完