NAR︱蔡玲/王刚/金坚团队合作揭示和靶向前列腺癌中EZH2的双重功能

撰文︱王  俊，王  刚，蔡  玲责编︱方以一，王思珍编辑︱杨彬薇

前列腺癌是在男性群体中最常诊断且发生的恶性肿瘤。雄激素去除治疗（Androgen deprivation therapy，ADT）是前列腺癌最常规的治疗方式，然而大多数病人在接受治疗之后不可避免的发展成去势抵抗前列腺癌(castration-resistant prostate cancer，CRPC）[1,2]。雄激素受体（Androgen receptor，AR）和Enhancer of Zeste Homolog 2 (EZH2) 均是前列腺癌非常重要的致癌因子。AR基因的过表达，AR配体结合区域（ligand-binding domain，LBD）的突变以及AR共结合因子介导的机制促进了AR信号通路的异常表达。此外，在CRPC中，AR基因可以通过可变剪切产生截短的荷尔蒙非依赖并且持续高表达的AR突变体，例如AR-V7 [3]。EZH2是Polycomb repressive complex 2（PRC2）复合物主要催化亚单元，通过其SET结构域催化组蛋白H3赖氨酸27的三甲基化修饰（H3K27me3），从而促进下游靶基因的沉默表达。除了依赖于PRC2复合物的转录抑制功能之外，在前列腺癌中EZH2还可以通过结合非PRC2复合物的蛋白例如AR和fibrillarin来促进转录激活或者翻译[4-6]。

此前在2022年初2月由北卡罗来纳大学教堂山分校的王刚（Drs. Greg Wang）以及西奈山伊坎医学院的金坚（Jian Jin）领导的研究团队在Nature Cell Biology杂志上阐述了在急性骨髓性白血病（Acute myeloid leukemia，AML）中EZH2可以通过一个隐藏的转录激活结构域（cryptic transactivation domain，TAD）结合cMyc和p300促进下游基因转录激活和肿瘤发生[7]。然而，EZH2^TAD的功能在前列腺癌中并没有得到阐明。此外虽然有很多证据表明EZH2对于前列腺癌的肿瘤发生至关重要，针对EZH2 SET结构域的小分子酶活抑制剂已经进入临床试验，然而小分子抑制剂只能够抑制EZH2的酶活功能，但是不能影响EZH2的转录激活功能。因此可以预见在临床上用EZH2酶活抑制剂治疗前列腺癌的局限性，然而针对前列腺癌的治疗迫切需要开发能够抑制EZH2双重功能的治疗手段。

2022年10月28日，由北卡罗来纳大学教堂山分校的蔡玲，王刚和西奈山伊坎医学院的金坚领导的研究团队再次在Nucleic Acids Research（NAR） 杂志上在线发表题为“A cryptic transactivation domain of EZH2 binds AR and AR’s splice variant, promoting oncogene activation and tumorous transformation”的研究论文，揭示了EZH2在前列腺癌中致癌机制中的经典及非经典功能，并且通过利用蛋白质水解靶向嵌合体（PROTAC）小分子药物来靶向和抑制EZH2的双重功能，为治疗前列腺癌提供一种新的治疗策略。

作者首先比较了在前列腺癌细胞系22Rv1中EZH2和H3K27me3的CUT&RUN以及开放染色质ATAC-seq的染色质结合数据，发现EZH2大约有65.5%结合在开放染色质区域（称为EZH2_solo区域），此区域富集了开放染色质修饰H3K27ac，H3K4me3以及BRD4和Pol II（图1）。此外，EZH2大约有34.5%与H3K27me3共定位（称为EZH2_ensemble区域），该区域染色质处于封闭状态（图1）。作者进一步发现EZH2_solo区域与AR以及AR-V7结合区域具有较好的共定位（图1），显示EZH2和AR或者AR-V7可能存在共同激活下游基因的功能。

图1 EZH2 non-canonically binds genomic sites with gene-active markers, Pol II, BRD4, AR and AR-V7 in prostate cancer cells.

（图源：Wang, et al., NAR, 2022 ）

进一步通过RNA-seq结果显示EZH2和AR以及AR-V7共同调控和激活了一系列重要的基因。这些基因主要富集在细胞周期, 胆固醇代谢以及DNA修复相关的通路，其中包括了致癌基因CDK2以及MYBL2，分析显示这些基因的表达水平和前列腺癌病人的生存具有明显的相关性。同时在TCGA前列腺癌病人样本中，EZH2以及AR的表达和这些基因的表达水平同样也具有很高的相关性。作者通过EED degrader （UNC6852）或者EZH2酶活抑制剂（C24）靶向EZH2经典功能均不能下调这些EZH2和AR以及ARV-7共同激活的靶基因，然而通过p300抑制剂（A485）却可以显著下调这些基因表达。ChIP-qPCR结果显示AR或者AR-V7对于EZH2招募到这些致癌靶基因的结合区域至关重要。

图2 Venn diagram of the common genes regulated by EZH2, AR and AR-V7 in prostate cancer cells.

（图源：Wang, et al., NAR, 2022 ）

先前已经有报道EZH2和AR有蛋白互作[6]。作者进一步研究发现EZH2和AR或者AR-V7的结合通过EZH2-TAD结构域介导。而AR和AR-V7共有的N端结合区域（N-terminal domain，NTD）的aa 1-180 (富含Q，polyQ区域) 以及aa 321-503（富含G，polyG区域）与EZH2-TAD结合(图 3)。已知ployQ区域和ployG区域均存在无序结合区域（intrinsic disordered region，IDR）[8]，而EZH2-TAD也存在部分无序结合区域，因此推测EZH2和AR或者AR-V7的结合可能由相分离（phase sepratation）介导。作者进一步证实了EZH2-TAD介导EZH2结合到EZH2_solo区域。并且EZH2-TAD对于前列腺癌的肿瘤细胞增殖以及肿瘤形成（in vitro and in vivo）均具有重要作用。

图3 Interaction between EZH2TAD and AR or AR-V7.

（图源 Wang, et al., NAR, 2022 ）

为了能够有效的靶向EZH2-AR/AR-V7的非经典复合物，研究人员选择使用蛋白质水解靶向嵌合体（PROTAC）技术来靶向EZH2的催化与非催化功能。PROTAC通过将E3泛素连接酶招募到靶蛋白附近，形成三元复合物，进而诱导靶蛋白泛素化，从而被蛋白酶体识别和降解。该团队此前筛选到了一个新型EZH2 PROTAC小分子降解剂 MS177。在前列腺癌细胞中，MS177处理能够有效降解PRC2复合物组成部分（包括EZH2，SUZ12，EED），同时还可以有效地降解AR和AR-V7。作者证实AR以及AR-V7的降解依赖于泛素化并且依赖于EZH2-TAD和AR以及AR-V7的蛋白互作，证实其降解是on-target effect。MS177能够同时减弱EZH2, H3K27me3以及AR的染色质结合（图4）。并且相比较EZH2酶活抑制剂C24，MS177诱导了更强烈的基因表达水平变化。MS177不仅有效的上调表达经典的PRC2目的基因，同时还显著的下调AR以及AR-V7激活的基因表达水平（图5）。

图4 MS177 decreases genomic binding of both EZH2 and AR/AR-V7.

（图源：Wang, et al., NAR, 2022 ）

图5 MS177 on inhibiting both EZH2:PRC2- and AR/AR-V7-related oncogenic programs in prostate cancer cells

（图源：Wang, et al., NAR, 2022 ）

接下来，作者评估了MS177对于前列腺细胞系的抗增殖能力，相比较传统的小分子酶活抑制剂，MS177具有更高效的抑制细胞增殖能力，并且诱导细胞凋亡（图6）。作者同时发现在表达AR的前列腺癌细胞比不表达AR的前列腺癌细胞对MS177更敏感。但是在正常的前列腺癌细胞系RWPE-1中，MS177没有明显的细胞增殖抑制能力，显示MS177对于正常细胞没有明显的细胞毒性。

图6 EC50 values of MS177 in the indicated prostate cell lines

（图源：Wang, et al., NAR, 2022 ）

图7 A model showing MS177 target the canonical (EZH2:PRC2; top) and non-canonical (EZH2:AR:coactivators; bottom) complexes of EZH2 in prostate cancer.

（图源：Wang, et al., NAR, 2022 ）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，该研究进一步阐明了EZH2在前列腺癌症中的双重功能（图7），即既可以形成经典的PRC2复合物，介导下游基因的沉默；同时也可以形成非经典复合物（EZH2-TAD-AR/AR-V7-coactivator），以促进下游基因的转录激活。EZH2的双重功能均有助于肿瘤发生。而新开发的EZH2小分子降解剂MS177能有效的降解整个PRC2复合物同时降解AR和AR-V7，既可以抑制PRC2依赖的传统催化功能，也能破坏EZH2非传统复合物的形成，因此MS177具有比小分子酶活抑制剂更有效的肿瘤抑制效果，为治疗EZH2依赖性的前列腺癌提供一种新的治疗策略。然而虽然该小分子在细胞水平具有很好的肿瘤杀伤效果，但是在前列腺癌动物模型中确没有明显的抑制效果，因此未来需要针对特定模型进一步对小分子进行优化设计。

原文链接：https://doi.org/10.1093/nar/gkac861

北卡罗来纳大学教堂山分校王刚和蔡玲西奈山伊坎医学院金坚博士为本文的共同通讯作者。北卡罗来纳大学教堂山分校王俊博士和西奈山伊坎医学院Kwang-Su Park博士为共同第一作者。同时西奈山伊坎医学院余旭芬博士，北卡罗来纳大学教堂山分校宫伟达，刘喜娟博士以及Shelton Earp教授均为该研究提供了相关帮助。

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参考文献（上下滑动阅读）

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本文完