Redox Biol︱呼庆勋课题组发现半胱氨酸γ裂解酶硫巯基化Drp1改善心功能紊乱

撰文︱孙媛媛责编︱王思珍，方以一编辑︱王如华

心力衰竭是一种典型的心血管疾病终末期临床表现。截止2017年，全球心力衰竭患者已达到6430万人，除此之外还有数百万未诊断的心衰病例[1]。然而，在过去的二十年里，很少有新的治疗心力衰竭的医疗策略[2, 3]。 心力衰竭的治疗亟需新的治疗策略。心脏是一种高能量需求器官，所需的三磷酸腺苷(ATP)大部分来自线粒体的氧化代谢。 在生理条件下，线粒体动力学（包括线粒体的裂变及融合）稳态可以确保维持线粒体功能。动力相关蛋白1（Drp1）可以通过不同的方式被激活来驱动哺乳动物的线粒体分裂。之前的研究发现过量的脂质摄取增加Drp1活性，导致线粒体过度分裂和心脏功能障碍[4, 5]。因此，深入了解激活Drp1的分子机制及Drp1在心力衰竭治疗中的关键作用，对于开发治疗心力衰竭的新药物具有重要意义。

2022年10月28日，上海大学呼庆勋课题组在Redox Biology发表了题为“Cystathionine γ lyase S-sulfhydrates Drp1 to ameliorate heart dysfunction”的研究论文，揭示了CSE/H₂S通路可调节Drp1活性从而缓解心功能紊乱和心肌病理重塑；其机制主要通过硫巯基化Drp1的半胱氨酸607阻止Drp1活性、易位以及与VDAC1的相互作用，从而缓解线粒体功能障碍和心肌细胞死亡；靶向Drp1硫巯基化是一种潜在的改善心力衰竭有效途径。

首先作者利用异丙肾上腺素（ISO）构建小鼠心力衰竭模型，通过检测CSE基因（心肌细胞中重要的H₂S合成酶）敲除（CSE KO）小鼠和心脏CSE过度表达（CSE OE）小鼠心功能相关指标，发现CSE KO小鼠的射血分数和缩短分数显著下降，左心室舒张内径和左心室舒张末期容积显著增加（图1c-f）。然而， CSE过表达可以改善ISO诱导的小鼠心力衰竭，说明H₂S在心功能调节中起着重要作用。此外，CSE KO-ISO小鼠发生了更严重的心肌肥厚，以及心肌组织丢失，纤维化和细胞凋亡程度明显增加（图1g-j）。相反，在CSE OE-ISO小鼠中相关指标受到显著抑制（图1g-n）。这些数据表明CSE/H₂S通路介导了慢性β肾上腺素能受体激活过程中小鼠心功能紊乱的发生和心肌病理重塑。

图1 CSE/H₂S通路介导ISO诱导的心功能紊乱

（图源：D. Wu, et al., Redox Biology, 2022）

分裂蛋白的过度活化导致线粒体功能障碍和心力衰竭。糖尿病心肌病中脂质超载增加了Drp1活性和线粒体分裂[4, 5]。尽管已知H₂S在线粒体稳态中起着重要作用，但H₂S对线粒体形态调节作用的直接证据尚不清楚。在CSE KO-ISO心脏中Drp1活性增强，而在CSE OE-ISO心脏中Drp1活性恢复，提示H₂S抑制了Drp1的活性以调节线粒体分裂。Drp1从细胞质到线粒体的转运受多种信号和翻译后修饰的调节。Drp1的丝氨酸616(S616)磷酸化促进其易位，而Drp1的丝氨酸637(S637)磷酸化则抑制其易位。研究者发现在CSE KO-ISO心脏中，S616处Drp1磷酸化水平较高，S637处Drp1磷酸化水平较低。相反，这些变化在CSE OE-ISO心脏中减弱（图2d, e）。此外Drp1多聚体也受到了H₂S的调节（图2f, g）。这些结果说明H₂S在心力衰竭时调节Drp1的磷酸化、易位、多聚体形成和GTPase活性。

图2 CSE/H₂S通路调节心力衰竭中Drp1的活性

（图源：D. Wu, et al., Redox Biology, 2022）

越来越多的证据表明S-巯基化是H₂S产生生理影响的主要机制。WT-ISO心脏和线粒体中Drp1的S-巯基化水平显著降低。CSE缺乏进一步下调了Drp1的S-巯基化水平，而CSE在整个心脏或线粒体部分过度表达增强了Drp1的S-巯基化水平（图3a, b）。已有研究表明，一氧化氮(NO)S-亚硝基化Drp1，促进线粒体分裂，但S-亚硝基化与Drp1的S-巯基化之间的调节关系尚不清楚。研究者检测了心脏中诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白水平，发现WT-ISO和CSE KO-ISO心脏的iNOS蛋白水平显著增加，而CSE OE-ISO心脏的iNOS蛋白水平则有所减少（图3d）。这些数据提示H₂S参与iNOS途径的调控。增加H₂S水平显著减轻了Drp1蛋白的S-硝基化（图3e, f）。无论体外蛋白水平，还是细胞中直接抑制iNOS活性，H₂S仍能抑制Drp1的S-亚硝基化并促进Drp1S-巯基化（图3g, h）。这些结果表明H₂S与NO直接竞争性修饰Drp1。

图3 H₂S 巯基化DRP1并且调节Drp1的S-亚硝基化

（图源：D. Wu, et al., Redox Biology, 2022）

作者进一步研究Drp1上S-巯基化的半胱氨酸残基位点。序列比对显示Drp1具有四个不同的结构域，包括N端鸟苷三磷酸酶（GTPase）结构域、动力蛋白样中间结构域、B结构域和GTPase效应域(GED)(图4a)。将9个Drp1半胱氨酸进行突变来寻找发生S-巯基化的半胱氨酸残基。定点突变没有改变Drp1的表达和活性（图4b,c）H₂S增强了WT Drp1以及除C607A外的大多数点突变的S-巯基化（图4d），表明C607是发生S-巯基化的残基。C607在不同物种间的GED结构域中高度保守并处于活性的关键位置，表明H₂S通过调节Drp1的结构构象而激活Drp1的关键残基（图4e,f）。为了验证这一假设，ISO刺激Drp1活性，发现 Drp1磷酸化水平在Drp1 WT和大多数Drp1突变体中增强。然而，Drp1 C607A抑制Drp1磷酸化水平的增加（图4g）。这些实验证明C607被特异性S-巯基化，是Drp1活化的关键残基。

图4 在Drp1半胱氨酸607特异性硫巯基化修饰

（图源：D. Wu, et al., Redox Biology, 2022）

为了进一步证明S-巯基化Drp1的半胱氨酸607在调节Drp1活性和功能方面起着至关重要的作用，作者构建了含有Drp1 WT(Ad-Drp1 WT)和Drp1 C607A(Ad-Drp1 C607A)的腺病毒，并感染至成鼠心肌细胞，未影响Drp1的表达和活性（图5a）。随后作者检测了在ISO诱导心肌细胞线粒体分裂过程中，Drp1 C607处的硫巯基化的水平。Ad-Drp1 C607A过度表达的心肌细胞中几乎未发现S-巯基化（图5b）。而在Ad-Drp1 WT过表达的心肌细胞中，ISO处理增强了Drp1的S616磷酸化和GTPase活性（图5c,d）。H₂S抑制了ISO诱导的异常Drp1活性。然而，H₂S处理的Ad-Drp1 C607A过表达的心肌细胞中没有观察到Drp1的活性恢复（图5c,d）。为了进一步研究线粒体形态变化，研究者构建了含有GFP-Drp1 WT(Ad-GFP-Drp1 WT)和GFP-Drp1 C607A(Ad-GFP-Drp1 C607A)的腺病毒。ISO加剧了成鼠心肌细胞线粒体分裂，H₂S抑制了线粒体过度分裂。然而，H₂S孵育并没有消除ISO诱导的Ad-GFP-Drp1 C607A过表达的心肌细胞的线粒体分裂（图5e-g）。这些结果表明硫巯基化Drp1的半胱氨酸607是心肌细胞中Drp1激活的关键位点。

图5 Drp1半胱氨酸607硫巯基化调节其活性和线粒体分裂。

（图源：D. Wu, et al., Redox Biology, 2022）

为了进一步证实Drp1 C607在体内的重要作用，作者将Drp1及其突变体病毒原位注射心脏，并利用主动脉狭窄术构建心力衰竭模型。发现Drp1 C607A过表达心脏中S-巯基化和亚硝基化水平明显降低（图6a）。并且Drp1 C607A显著的抑制了H₂S保护作用，如线粒体分裂（图6b）及功能（图6c）、心脏功能（图6d-f）、心肌肥大（图6g, h）及细胞凋亡指标（图6i）等。

图6 Drp1半胱氨酸607硫巯基化体内调节其活性及心脏功能。

（图源：D. Wu, et al., Redox Biology, 2022）

最后作者探究了S-巯基化Drp1下游分子机制。电压依赖性阴离子通道1(VDAC1)在细胞凋亡中起重要作用。研究者通过免疫共沉淀寻找Drp1与VDAC1之间的联系。ISO增强了心脏Drp1与VDAC1的相互作用。这种相互作用在CSE KO-ISO心脏中进一步增强，而在CSE OE-ISO心脏中被抑制（图7a）。ISO增强了Drp1 WT与VDAC1之间的相互作用，但不增强Drp1 C607A与VDAC1之间的相互作用（图7b）。这些结果表明Drp1与VDAC1的结合受到S-巯基化修饰的调节。H₂S或特异性VDAC1抑制剂（VBIT-4）均能阻断Drp1 WT过表达的成鼠心肌细胞中ISO诱导的mPTP开放、ATP水平下降和凋亡，但这些影响能被Drp1 C607A过表达所阻断（图7c-e, g）。此外，线粒体NADH/NAD⁺比率是线粒体功能的关键指标，作者利用之前发明遗传编码荧光探针mt-SoNar [6]，实时展示了线粒体NADH/NAD⁺比率的变化（图7f）。结果表明H₂S介导Drp1和VDAC1之间的相互作用，从而改善ISO诱导的线粒体功能障碍和心肌细胞死亡。

图7 硫巯基化抑制Drp1和VDAC1的相互作用，调节ISO诱导的线粒体功能障碍

（图源：D. Wu, et al., Redox Biology, 2022）

图8 心衰中CSE/H₂S调节Drp1活性的机制

（图源：D. Wu, et al., Redox Biology, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究发现了一种新型的Drp1翻译后修饰形式，该修饰在体内外对异常线粒体分裂和心脏功能有保护作用。硫巯基化Drp1的半胱氨酸607调节Drp1磷酸化、GTPase活性以及与VDAC1的相互作用从而改善线粒体功能和心肌细胞凋亡。这些结果首次证实了Drp1的S-巯基化介导心脏线粒体功能（图8）。基于以上研究结果，通过靶向Drp1 S-巯基化并维持线粒体形态的干预措施可能是一种潜在的治疗心力衰竭的新策略。本研究仍有几个问题仍未解决，例如Drp1 C607如何影响其活性，以及Drp1-VDAC1相互作用的具体机制等。此外，越来越多的研究报道CSE利用半胱氨酸生成CysSSH，在细胞内翻译过程中可直接与目的蛋白结合。虽然H₂S水平与CSE表达水平相关，但仍存在一个潜在的分子途径，即CSE衍生的CysSSH可能直接结合到Drp1中。因此，CSE衍生的CysSSH是否对Drp1活性的有调节作用也是未来研究的一个重要方向。

原文链接：https://doi.org/10.1016/j.redox.2022.102519

上海市同济医院武丹副主任药师是本论文第一作者，上海市曙光医院谭波副研究员和上海大学研究生孙媛媛做出重要贡献，上海大学呼庆勋副教授是通讯作者。本研究工作得到国家自然科学基金、上海市自然科学基金、上海市浦江人才计划和上海市晨光计划等科研项目资助。

通讯作者：呼庆勋

（照片提供自：呼庆勋团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

呼庆勋，副教授，硕士生导师。主要从事线粒体代谢实时成像监测与精准调控，一方面致力于发展新型遗传编码的荧光探针，用于在时间和空间尺度上解析生理及病理情况下心脏、脑、血管系统的复杂功能；另一方面，借助先进的工具建立高通量筛选全新受体及先导化合物分析系统，为心脑血管疾病的诊治提供新理论和新方法。以第一作者（含共同）在Circulation Research，Developmental Cell,Cell Reports Methods, Redox Biology（3篇）和Antioxidants and Redox Signaling等主流期刊发表十余篇学术论文，入选上海市人才项目；主持1项国家自然科学基金项目；授权2项国际PCT专利和4项国内发明专利；担任Fronters in Cardiovascular Medicine客座编辑；荣获上海药学科技二等奖和美国心脏协会New Investigator Travel Award。

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参考文献（上下滑动阅读）

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本文完