Mol Ther︱桂耀庭/刘宇辰/于波团队发现单链核酸适配体具有降低CRISPR-Cas9脱靶与提升基因编辑同源重组修复的功能

撰文︱汪铭霞，黄新波，刘宇辰责编︱王思珍，方以一编辑︱杨彬薇

成簇的规律间隔的短回文重复序列（CRISPR）及其相关蛋白Cas9是一种简单高效的基因编辑工具，极大地推动了生命医学研究的进步，在基因遗传病与肿瘤治疗领域有重大应用前景[1]。但其脱靶率高以及靶位点编辑过程中较低的同源重组修复效率限制了该技术在临床的广泛应用[2]。因此，寻找合适的CRISPR-Cas9调控手段进一步优化该系统有重要的应用价值。

最近，北京大学深圳医院桂耀庭研究员、于波教授与深圳市转化医学研究院（深圳市第二人民医院）刘宇辰副研究员课题组合作在Molecular Therapy（Mol Ther）上发表了题为“Screening DNA aptamers that control the DNA cleavage, homology-directed repair, and transcriptional regulation of the CRISPR-(d)Cas9 system”的论文。该研究成功筛选出对Cas9蛋白具有高亲和力和高特异性的单链DNA适配体；继而利用这些适配体，显著降低CRISPR-Cas9的脱靶率并提升其同源重组修复效率。

Cas9是一种来自II型CRISPR系统的多结构域核酸内切酶，通过gRNA引导识别其靶位点，在PAM区上游三个碱基的位置留下钝性双链DNA断裂（DSB）[3]。过往基于该系统开发的各种基因编辑和调控工具已有部分投入临床实验[4-5]。但其脱靶编辑为临床应用安全性带来了较高的不确定性，靶点编辑过程中较低的同源重组修复效率阻碍了目标基因功能的回补，限制了该技术在临床的广泛应用[2]。适配体是具有与抗体类似功能的核酸，可以结合特定的靶点，如蛋白质、核酸和代谢物。与抗体相比，它们有合成简单、成本低廉、稳定性高、毒性和免疫原性低等明显优势[6]。研究团队设想通过筛选能与Cas9蛋白特异性结合的适配体，调节Cas9功能，增加特异性，并将修复模板富集到Cas9编辑留下的DSB附近，提升同源重组修复效率。

研究团队通过SELEX筛选与Cas9蛋白结合的单链DNA（ssDNA）适配体（图1A），并选择了结合效率最高的5条适配体序列进行验证分析。通过MC-Fold/MC-Sym预测适配体的二级结构，并利用HDOCK服务器预测Cas9蛋白与适配体之间的对接，并发现适配体与Cas9蛋白之间具有良好的结合力（图1B）。

图1. 与Cas9蛋白有结合能力的适配体的筛选与分子对接

（图源：Huang XB, et al. Mol Ther, 2022）

接着，研究团队将适配体用于细胞层面上CRISPR-dCas9的转录调控。他们通过流式细胞术验证dCas9-VPR激活EGFP报告基因的转录激活系统与dCas9-KRAB抑制EGFP报告基因的转录抑制系统。在适配体存在的情况下，由于其与dCas9蛋白具有高度的亲和力，对DNA/gRNA/dCas9复合体形成的干扰显著限制了CRISPR-dCas9的转录调控功能（图2）。此外，他们将两个系统中gRNA的spacer序列连接到适配体的3’或5’端，并测试串联序列对CRISPR-dCas9体系的影响，发现同样具有显著的干扰效果（图2D）。

图2 适配体干扰CRISPR-dCas9转录调控的效率

（图源：Huang XB, et al. Mol Ther, 2022）

随后，研究团队验证了适配体对HEK293T细胞中Cas9基因编辑的影响。他们编辑了多个靶点，并通过T7E1酶切检测对靶点编辑率与脱靶编辑率进行分析。例如，在75μM适体5的处理下，无法观察到VEGFA 1的脱靶编辑，而靶点编辑率保持在约40%（图3A）。对靶点VEGFA 2，在37.5μM适配子5处理时，非靶标编辑大约减半，而靶点编辑率基本保持不变（图3B）。研究结果表明，适配体以剂量依赖的方式对脱靶编辑有更强的抑制作用。

图3 适配体干扰CRISPR-Cas9的剪切与脱靶效率

（图源：Huang XB, et al. Mol Ther, 2022）

此外，研究团队通过稳定表达突变型GFP的HEK293T细胞株研究CRISPR-Cas9编辑中的同源重组修复效率。通过将适配体序列与ssDNA修复模板进行串联，促进修复模板在Cas9蛋白周围的富集，增加同源重组修复的效率（图4A）。通过流式分析结果表明，适配体串联修复模板的实验组均可提高GFP基因的修复效率，且修复效率与串联模板浓度正相关（图4B）。同时，他们还对比了通过适配体串联富集修复模板与将修复模板与Cas9蛋白共价结合对同源重组修复效率的差异。结果表明，适配体富集模板的实验组有更高的修复效率。由此可见，适配体调节下的CRISPR-Cas9体系不仅具有更高的编辑特异性，对编辑后的同源重组修复也有良好的促进作用。

图4 适配体富集修复模板提高编辑后同源重组修复效率

（图源：Huang XB, et al. Mol Ther, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，研究团队筛选了一批能够与Cas9蛋白有效结合并干扰CRISPR基因编辑和转录调控功能的单链DNA适配体序列，作为对CRISPR系统灵活调控的新模块，可有效降低基因编辑过程中的脱靶作用。另外，该研究提出了适配体可应用于增强基因编辑过程中的同源重组修复，提供了一种成本低廉、操作简单，对细胞损伤较小同源重组修复新方法。

然而，适配体对Cas9靶点编辑效率的干扰会影响其作为基因治疗工具的应用，随着未来对适配体与蛋白结构间相互作用的深入研究，能够分析二者的相互作用是如何导致各种效应的。这一见解将对如何优化适配体功能提供更多信息，从而在提高特异性与同源重组修复的同时降低对剪切效率的影响，并有可能将其应用于疾病治疗。

原文链接：https://www.cell.com/molecular-therapy-family/moleculartherapy/fulltext/S1525-0016(22)00621-9#relatedArticles

北京大学深圳医院黄新波博士、汪铭霞博士研究生、吴瑕博士为该论文共同第一作者，北京大学深圳医院中心实验室桂耀庭研究员/皮肤病研究所于波教授，深圳市转化医学研究院刘宇辰副研究员为该论文共同通讯作者。本研究受到国家自然科学基金、国家重点研发计划、广东省高水平医院建设基金、深圳市重点医学学科建设基金等项目的支持。

通讯作者：桂耀庭（左），刘宇辰（中），于波（右）

（照片提供自：桂耀庭/刘宇辰/于波团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

桂耀庭，医学博士，北京大学博士生导师，北京大学深圳医院研究员。从事生殖医学和基因组学等基础研究30年。在Cell, Nature Genetics, Nature Biotechnology, Science Translational Medicine, Molecular Cancer, PLoS Genetics, FASEB Journal, Biology of Reproduction 和 Human Reproduction等期刊发表SCI论文178篇；获得各级科技成果奖10项和国家发明专利3项，获广东省自然科学一等奖和国家教育部自然科学二等奖。主持各级科研项目33项，包括国家重点研发计划项目子课题2项、国家自然科学基金5项。

刘宇辰，医学博士，深圳市转化医学研究院（深圳市第二人民医院）副研究员，国家重点研发计划青年首席科学家，主要从事医学合成生物学研究，以第一或通讯作者在Nature Methods、Genome Biology、Nature Communications、eLife等期刊发表论文，并授权国家发明专利12项。

于波，北京大学医学部教授、博导，深圳市地方级领军人才。在Br J Dermatol, Arthritis & Rheumatism, Contact Dermatitis等期刊发表SCI论文30余篇，副主编专著《实用儿童皮肤病学》，副主译专著《Bolognia Dermatology》4nd Editioon，参编《皮肤性病科临床实践-导引与图解》（国家规划教材）、《皮肤病与性病图谱》（国家规划教材）、《皮肤美容激光治疗原理与技术》等专业论著。获深圳市科技进步奖二等奖一项。主持国家自然科学基金面上项目2项和省厅级科研项目12项。

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参考文献（上下滑动阅读）

[1] Pickar-Oliver A, Gersbach CA: The next generation of CRISPR-Cas technologies and applications. Nat Rev Mol Cell Biol 2019, 20:490-507.

[2] Ran FA, Hsu PD, Lin CY, Gootenberg JS, Konermann S, Trevino AE, et al: Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editing specificity. Cell 2013, 154:1380-1389.

[3] Jinek M, Chylinski K, Fonfara I, Hauer M, Doudna JA, Charpentier E: A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science 2012, 337:816-821.

[4] Meisel R: CRISPR-Cas9 Gene Editing for Sickle Cell Disease and beta-Thalassemia. N Engl J Med 2021, 384(23):e91.

[5]Stadtmauer EA, Fraietta JA, Davis MM, Cohen AD, Weber KL, Lancaster E, et al: CRISPR-engineered T cells in patients with refractory cancer. Science 2020, 367(6481):eaba7365.

[6] Zhou J, Rossi J: Aptamers as targeted therapeutics: current potential and challenges. Nat Rev Drug Discov 2017, 16:181-202.

本文完