Nat Commun︱广州医科大学陈鑫等发现EIF4E促铁死亡新功能

撰文︱陈   鑫

责编︱方以一，王思珍

编辑︱杨彬薇

铁死亡（ferroptosis）主要由不受限制的脂质过氧化驱动，这个动态过程主要涉及活性氧（ROS）攻击脂质，尤其是细胞膜或细胞器膜中的多不饱和脂肪酸（PUFA）[1]。脂质过氧化过程受到一些促氧化酶，例如脂氧合酶（ALOXs）、细胞色素P450氧化还原酶（POR）和NADPH氧化酶（NOXs）的正向调节[2,3]。相反，多种抗氧化系统，包括谷胱甘肽过氧化物酶4 （GPX4）、凋亡诱导因子线粒体相关2（AIFM2/FSP1）等在铁死亡期间发挥抑制脂质过氧化的作用[4]。脂质过氧化的最终产物是生成多种醛类代谢物，包括丙二醛（MDA）和4-羟基壬烯醛（4HNE）等。尽管铁死亡过程中脂质过氧化的调控机制已取得了很大进展，但一个未解决的关键问题是脂质过氧化产物是否以及如何影响细胞铁死亡。

真核起始因子4E（eukaryotic initiation factor 4E，EIF4E）是真核起始因子蛋白质家族成员，通过特异性地识别mRNA的5'端的帽子结构，在翻译起始过程中发挥重要作用。EIF4E与真核起始因子4G1（EIF4G1，也称为EIF4G）形成翻译起始复合物，介导mRNA募集到核糖体。EIF4E在人类癌症中广泛过度表达，研究表明它可以作为促癌蛋白，促进肿瘤细胞增殖和耐药性。因此，EIF4E被认为是重要的抗肿瘤治疗靶点。然而，EIF4E的非经典翻译功能较少报道。

2022年10月23日，广州医科大学陈鑫副研究员和刘金保教授课题组以及美国德克萨斯大学西南医学中心Rui Kang和Daolin Tang课题组合作在Nature Communications上发表了题为“A noncanonical function of EIF4E limits ALDH1B1 activity and increases susceptibility to ferroptosis”的研究。该研究基于药物库筛选及免疫沉淀-质谱发现EIF4E具有一种意想不到的非翻译功能，可促进肿瘤细胞发生铁死亡。EIF4E与醛脱氢酶1家族成员B1（Aldehyde dehydrogenase 1B1，ALDH1B1）结合以限制ALDH1B1介导的4HNE清除。作者发现4HNE不仅是脂质过氧化的产物，也能通过促进脂质过氧化引起铁死亡。该研究可能为理解铁死亡的效应机制提供一个新的代谢理论基础。

为了鉴定铁死亡的重要调节因子，作者使用靶点选择性抑制剂药物库（431种）与GPX4抑制剂RSL3联合处理HT-1080细胞，确定两个小分子化合物4EGI-1和4E1RCat能够抑制铁死亡诱导剂RSL3引起的细胞毒性（图1a-d）。并且，4EGI-1和4E1RCat对多种铁死亡诱导剂包括RSL3、erastin、ML162、ML210、FIN56和FINO2等诱导的细胞死亡均有抑制作用（图1c）。同时，作者发现4EGI-1和4E1RCat可以抑制RSL3和erastin诱导的脂质过氧化，但对细胞内铁离子没有影响（图1d,e）。与经典的铁死亡抑制剂ferrostain-1和liproxstatin-1不同，4EGI-1和4E1RCat在体外不具有抗氧化性（图1f,g）。4EGI-1和4E1RCat也与铁离子络合剂不同，在体外不能够结合铁离子（图1h）。以上结果证明4EGI-1和4E1RCat可以作为铁死亡的新型抑制剂。

图1 4EGI-1和4E1Rcat抑制铁死亡

（图源：Chen X, et al., Nat Commun, 2022）

既往研究报道4EGI-1和4E1RCat通过结合EIF4E，抑制EIF4E-EIF4G1复合物形成，从而减少蛋白质合成[5,6]。作者发现使用两种不同的shRNA对EIF4E的敲低（图2a）确实限制了RSL3或erastin诱导的细胞毒性（图2b）、细胞死亡（图2c）和脂质过氧化（图2d）。作者进一步通过翻译组学、干扰EIF4G1及MKNK1基因、突变EIF4E翻译活性位点等手段明确了EIF4E通过非翻译功能促进铁死亡。

图2 EIF4E促进铁死亡

（图源：Chen X, et al., Nat Commun, 2022）

作者推测EIF4E除了与EIF4G1形成经典的翻译起始复合物外，也可能结合其他蛋白影响铁死亡。因此，作者进一步通过免疫沉淀-质谱方法，检测与EIF4E结合的蛋白。除检测出大量已知的经典的EIF4E结合蛋白，作者发现在HT-1080和Calu-1两种细胞中RSL3引起EIF4E与7种蛋白质结合增加（图3a）。进一步的基因干扰实验证明，只有敲低ALDH1B1，才能逆转EIF4E缺失细胞对铁死亡耐药（图3b-e），表明ALHD1B1可能作为EIF4E的下游信号。 通过Co-IP实验，进一步证明了RSL3可以促进EIF4E结合ALDH1B1，但不影响EIF4E与EIF4G1、EIF4G2及4EBP1等翻译相关蛋白的结合；EIF4E也不结合ALDH家族其他蛋白例如ALDH3A1和ALDH3A2（图3f）。以上结果证明EIF4E可以通过特异性结合ALDH1B1，发挥调控铁死亡的作用。

图3 EIF4E-ALDH1B1复合物介导铁死亡的发生

（图源：Chen X, et al., Nat Commun, 2022）

4HNE是脂质过氧化过程中产生的主要醛，是铁死亡的生物标志物之一。然而，尚不清楚4HNE的产生是否会反馈性影响细胞对铁死亡的敏感性。ALDH家族蛋白具有不同醛代谢的活性，包括可以催化毒性较大的4HNE氧化为毒性较小的相应酸。ALDH1B1先前已被报道具有代谢4HNE的活性，尽管在无细胞体外系统中其结合亲和力及催化效率低[7,8]。结合前面的结果，作者提出假设认为ALDH1B1可能代谢4HNE，从而抑制铁死亡。免疫荧光结果表明，过表达EIF4E的细胞内4HNE生成增加，并且这种效应可以被过表达ALDH1B1所抑制（图4a）。并且过表达ALDH1B1可以逆转外源性4HNE引起的细胞毒性效应（图4b）。相反，ALDH1B1敲低细胞中，外源性4HNE诱导的细胞死亡可以被铁死亡抑制剂ferrostain-1逆转，提示在4HNE代谢酶ALDH1B1缺失的情况下4HNE可以促进铁死亡（图4c）。同时，外源性添加4HNE也可以恢复EIF4E缺失的铁死亡耐药细胞对铁死亡的敏感性（图4d）。此外，作者证实低剂量4HNE能够通过活化NOX1，而不是NOX2（CYBB），促进RSL3和erastin诱导的铁死亡（图4e-h）。以上结果证明4HNE不仅是铁死亡的标志物，而且能够通过正反馈促进铁死亡的发生。

图4 4HNE是脂质过氧化的产物及促进因子

（图源：Chen X, et al., Nat Commun, 2022）

作者进一步探究了EIF4E-ALDH1B1-4HNE轴对裸鼠在体移植瘤中铁死亡的影响。与细胞实验中的发现一致，相比对照组，铁死亡诱导剂IKE介导的肿瘤抑制在EIF4E敲低组中减弱，但在ALDH1B1敲低组中增强（图5a-c）。作者进一步检测了肿瘤中4HNE和铁死亡的生物标志物PTGS2的表达，进一步支持了在体内EIF4E通过抑制ALDH1B1从而促进铁死亡的假设（图5d,e）。

图5 EIF4E和ALDH1B1调节在体铁死亡的敏感性

（图源：Chen X, et al., Nat Commun, 2022）

作者还评估了高剂量4HNE（5 mg/kg）对裸鼠在体移植瘤的影响。局部瘤内注射4HNE抑制了HT-1080肿瘤的生长。同时注射铁死亡抑制剂liproxstatin-1能够逆转4HNE引起的肿瘤抑制，而凋亡抑制剂ZVAD-FMK不能逆转（图6a,b），表明高剂量4HNE可以在体内引发铁死亡。 

图6 4HNE通过在体内诱导铁死亡来抑制肿瘤生长

（图源：Chen X, et al., Nat Commun, 2022）

图7 EIF4E-ALDH1B1通过调节4HNE代谢促进NOX1介导的铁死亡

（图源：Chen X, et al., Nat Commun, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，该研究揭示了（真核起始因子4E）在铁死亡中的新作用：EIF4E通过

抑制醛脱氢酶1家族成员B1（ALDH1B1）活性，引起毒性4HNE的积累，从而促进NOX1介导的脂质过氧化（图7）。尽管作者证明EIF4E-ALDH1B1-NOX1通路调节癌细胞中的铁死亡，但EIF4E依赖性铁死亡的生理作用仍未确定。同时，小鼠模型仅部分模拟了人类肿瘤的病理和临床特征。激活EIF4E依赖性铁死亡对肿瘤治疗的意义需要在人体临床试验中进一步验证。NOX1可能不是4HNE介导的细胞毒性的唯一介质，因为4HNE 可引起许多蛋白质、脂质和DNA的共价修饰。无论如何，4HNE-NOX1通路可能参与脂质过氧化的正反馈循环，从而加速铁死亡。作者证明了4HNE不仅是脂质过氧化的产物，而且通过激活NOX1形成正反馈以加速脂质过氧化。总之，这种以前未被认识的脂质毒性代谢机制可能为癌症治疗提供新的见解。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-34096-w

通讯作者：陈鑫（左），刘金保（右）

（照片提供自：广东省蛋白质修饰与降解重点实验室陈鑫/刘金保团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

陈鑫，肿瘤学博士，副研究员，广州医科大学南山学者，广东省蛋白质修饰与降解重点实验室科研骨干。曾于2018年至2020年赴美访学2年。主要研究方向是细胞死亡的新型调控机制及相关药物的研发。近三年以第一/通讯作者身份在Nature Communications、Nature Reviews Clinical Oncology、Nature Reviews Gastroenterology & Hepatology、Autophagy、Cell Death & Differentiation、Journal of Experimental Medicine等期刊发表细胞死亡相关论文。主持国家自然科学基金、省市级课题多项。

刘金保，博士，广州医科大学教授。中国病理学会蛋白质修饰与疾病专委会主任委员，广东省蛋白质修饰与降解重点实验室主任。长期从事蛋白质修饰、降解与疾病的研究。获得教育部自然科学二等奖，广东省优秀教学成果二等奖，广州市科技进步一等奖和中华医学会科技三等奖各1项，发表SCI论文大于100篇。

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参考文献（上下滑动阅读）

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本文完