Commun Biol︱谭砚文/刘海广团队合作揭示隐花色素的光响应构型变化及分子作用机制
责编︱方以一，王思珍
编辑︱杨彬薇
隐花色素（cryptochrome，CRY）是光感应受体（photoreceptor），广泛存在于动物、植物和昆虫体内。该类蛋白具有丰富多彩的重要功能，涉及动植物的生理时钟调控（circadian rhythm）[1-4]，藻类的基因修复（DNA repair）[5-6]，以及昆虫、鸟类的地磁感应（magnetic sensing）[7-10] 等。结构上，该类蛋白分子包含两个结构域：近氨基端的PHR结构域（photolyase homology region domain）和近羧基端的CTE结构域（carboxyl-terminal extension domain）。其中，PHR结构域的氨基酸序列较为保守，结构稳定；而CTE结构域氨基酸序列在不同物种甚至同一物种的不同亚类之间，存在较大差别；科学家们对其结构信息更是知之甚少。研究表明，CTE结构域对隐花色素执行功能非常重要：例如，CTE结构域的过表达会影响拟南芥的光响应表型[11]，位于CTE结构域上的exon 11缺失会引发人类的睡眠相位延迟综合征（delayed sleep phase disorder，DSPD）[12]，此外，CTE结构域的缺失还会影响果蝇和鸽子对地磁响应的敏感程度[13-14]。然而，隐花色素的CTE结构域究竟是怎样实现上述功能的，至今仍缺少分子层面上的机理。
2022年10月18日，复旦大学物理系表面物理国家重点实验室谭砚文研究组、北京计算科学研究中心刘海广研究组合作在国际学术期刊Communications Biology在线发表了题为“Direct experimental observation of blue-light induced conformational change and intermolecular interactions of cryptochrome”的研究结果，揭示了莱茵衣藻的动物型隐花色素（Chlamydomonas reinhardtii animal-like cryptochrome, CraCRY）CTE结构域蓝光诱导的构象变化，并证明该蓝光诱导的新构型可促使隐花色素与ROC15（Rhythm Of Chloroplast 15，莱茵衣藻内与节律相关的转录因子之一）发生相互作用，从而开启下游的信号传递。
研究者利用单分子荧光共振能量转移技术（Single-molecule Förster resonance energy transfer，smFRET），在单个分子尺度上，监测出在蓝光诱导之下，CraCRY的PHR结构域和CTE结构域之间会发生大小约为15 Å （Dark: 50 ± 13 Å，Lit: 65 ± 12 Å）的距离变化（图1a, b），该结果为这两个结构域之间的蓝光依赖构象变化提供了直接证据，并精准给出了此构象变化发生的区域和大小。同时，利用X射线小角散射技术（small-angle X-ray scattering，SAXS），研究者首次给出了CraCRY蛋白在黑暗（Dark）和光照（Lit）条件下较为可能的全长结构（图1c）；并且，SAXS结果给出的PHR结构域和CTE结构域之间蓝光诱导的距离变化大小约为17 Å，与前述smFERT的结果吻合较好。上述信息为后续从结构上理解该蛋白的功能机制提供了可靠的基础。
图1 smFRET及SAXS证明CraCRY存在蓝光诱导下的构象变化
（图源：Li, P, Cheng, HQ, et al., Commun Biol, 2022）
为了进一步研究构象变化与蛋白功能之间的关系，完善功能机制，研究者利用GST Pull-down技术，找到了莱茵衣藻体内调控节律的ROC15蛋白与CraCRY存在蓝光依赖相互作用的直接证据，并通过单分子荧光共定位技术（Co-localization Single-Molecule Spectroscopy，CoSMos），在单分子层面上再次证明了此相互作用的存在。那么，在真实的活细胞环境内，这一相互作用又是怎样的呢？借助双分子荧光互补技术（Bimolecular fluorescence complementation，BiFC），研究者在莱茵衣藻活细胞内监测到了蓝光照射下，作为相互作用探针的mCitrine荧光蛋白的荧光寿命信号，并且实验组的荧光强度也明显高于对照组（图2a, b）。结合此前Franz-Badur等科学家用分子排阻层析（size-exclusion chromatography，SEC）方法证明的CraCRY蛋白存在蓝光诱导的同源二聚化行为[15]，至此，CraCRY在蓝光诱导下的行为已增至三项：构象变化、同源二聚化、与ROC15的相互作用。
图2 BiFC于体内证明CraCRY与ROC15的分子间相互作用
（图源：Li, P, Cheng, HQ, et al., Commun Biol, 2022）
那么，这三种行为彼此之间存在什么关系，它们是如何协同合作执行功能的呢？研究者进一步利用精心设计的单分子实验给出了答案。首先，将单个未被标记的CraCRY蛋白固定在玻片上，然后将其他多余的结合位点阻碍掉；随后，在蓝光照射之下，环境中具有荧光标记的游离CraCRY会因为同源二聚化作用再次被抓牢（图3a）；此时，利用smFRET技术检测那些具有荧光标签的蛋白构象，即可获得二聚化后CraCRY的准确构型。同理，将被荧光标记的CraCRY蛋白先行固定在玻片上；随后，在蓝光照射之下，环境中具有荧光标记的游离的CraCRY、ROC15蛋白会竞相因为同源二聚化以及蛋白间相互作用而被玻片上已有的CraCRY蛋白抓牢（图3b）；此时，利用单分子荧光共定位和荧光漂白技术，就可以准确统计出以下四组数据：1）同源二聚化占比；2）相互作用占比；3）同源二聚化中发生相互作用占比；4）相互作用中发生同源二聚化占比。最终，研究者发现，蓝光诱导下，CraCRY与ROC15的结合和同源二聚化之间是互斥关系；再结合smFRET和SEC-SAXS给出构象信息，可推出，CraCRY的CTE结构域在蓝光诱导下的打开状态有助于其与ROC15发生相互作用，从而开启下一步的信号传递；相比之下，同源二聚体更加紧凑的构型则暗示二聚化过程极有可能是CraCRY蛋白对强烈的光响应的一种保护机制。
图3 单分子实验设计
（图源：李培（第一作者）博士毕业论文）
图4 CraCRY的分子作用机制
（图源：Li, P, Cheng, HQ, et al., Commun Biol, 2022）
值得注意的是，限于样品纯度、表达纯化难度、SAXS技术的精度以及单分子技术的光谱和时间分辨能力，此项研究尚未给出CraCRY与ROC15蛋白复合体的准确构型，但在现有构型中发现，它们的结合面和已知的CraCRY的DNA接合面有所重合，这与CraCRY蛋白的基因修复功能之间是否存在联系还有待进一步验证。此外，尽管确认了二聚化后CraCRY的CTE结构域更倾向于接近PHR结构域的紧凑构型，但其在形成二聚体之前，是否经历了打开的过程，尚未可知，仍有待进一步探索。
原文链接：https://doi.org/10.1038/s42003-022-04054-9
复旦大学物理系博士生李培（现为宁波大学物理科学与技术学院讲师）、程化强为第一作者，复旦大学物理系谭砚文教授、微软研究院科学智能中心(AI4Science)首席研究员刘海广研究员为共同通讯作者。该研究受到国家自然科学基金（No. 11274076, No. 21773039, No. 31971136, No. U1930402）、上海市科技重大项目（No.2018SHZDZX01）、张江实验室等基金资助。韩国高等研究院的Jooyoung Lee团队对于结构预测给予了帮助和支持。上海同步辐射中心BL19U2生物小角散射线站提供了强大的机时支撑，李娜研究员为SAXS数据采集和分析提供了专业指导。
通讯作者：谭砚文（左）；刘海广（右）
（照片提供自：谭砚文/刘海广团队）
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本文完