Nat Commun︱尹文兵团队发现真菌合成黄酮柚皮素的新途径

撰文︱尹文兵，张宏娇责编︱方以一，王思珍编辑︱杨彬薇

黄酮类化合物是自然界广泛存在的多酚类次级代谢物，具有良好的生理和药理活性，如抗癌、抗氧化、抗糖尿病等，使得其成为医药和功能食品行业的热点分子。柚皮素作为黄酮类化合物的通用中间体，其合成途径已经被解析清楚。在植物[1]和细菌[2]中，柚皮素的合成以对香豆酸为底物，先经4-香豆酰辅酶A连接酶（4CL）催化生成对香豆酰辅酶A。然后，一分子对香豆酰辅酶A与三分子丙二酰辅酶A经III型PKS查尔酮合成酶（CHS）缩合生成柚皮素查尔酮，最后经查尔酮异构酶催化或pH改变自发形成柚皮素。值得一提的是，虽然4CL和CHS已在一些植物内生真菌[3,4]中被鉴定，但并没有遗传或生化证明它们的功能。目前真菌中也没有其他酶催化合成柚皮素的报道。

2022年10月26日，中国科学院微生物研究所尹文兵研究员在Nature Communications上发表了题为“A fungal NRPS-PKS enzyme catalyses the formation of the flavonoid naringenin”的研究。该研究基于基因组挖掘从植物内生真菌中鉴定了一个新的真菌NRPS-PKS杂合酶FnsA，该酶催化对香豆酸或对羟基苯甲酸为底物直接合成柚皮素，为微生物高效生产黄酮类化合物提供新途径。

本研究中，研究者从2000个真菌基因组中搜索到502个真菌NRPS-PKS杂合酶，其中只有五个NRPS-PKS（TAS1、SwnK、HispS、AnATPKS、HppS）的功能已鉴定，剩下99%的NRPS-PKS功能未知（图1a）。研究者聚焦于一株次级代谢产物丰富的植物内生真菌Pestalotiopsis fici CGMCC3.15140（P. fici），并从中挖掘到一个NRPS-PKS杂合酶FnsA（A-T-KS-AT-DH-KR-ACP-TE），该酶与Aspergillus campestris中推测催化黄酮化合物chlorflavonin骨架形成的NRPS-PKS杂合酶（P168DRAFT_323099）具有64.3%的同源性。为了研究FnsA的功能，研究者敲除了fnsA，结果发现，与野生型相比，敲除株次级代谢产物未发生明显变化（图1c），这说明fnsA是沉默的，该结果与前期转录组结果一致。为了激活fnsA的表达，研究者将fnsA在构巢曲霉中进行异源表达，HPLC结果表明fnsA构巢突变株相较于对照组产生了两个新的化合物峰（1和2），通过化合物分离和结构鉴定，最终确定1和2分别是为柚皮素（1）和柚皮素查尔酮（2）（图1d）。

图1 真菌NRPS-PKS杂合酶FnsA的挖掘与功能鉴定

（图源：Zhang H. et al., Nat Commun, 2022）

为进一步研究FnsA的功能，研究者将fnsA在酿酒酵母中进行异源表达，分析fnsA酵母突变株次级代谢产物后发现有微量的1产生（图2a），研究者推测这可能是酵母中FnsA的底物供应不足导致的。于是研究者进行了酵母体内的底物饲喂实验，结果发现当喂养对香豆酸（3）或对羟基苯甲酸（4）后，1的产量能得到显著提高（图2b）。进一步地，喂养氘代标记底物3-d₆和4-d₄到fnsA酵母突变株后，LC-MS分析显示柚皮素的分子量相应地增加6 Da和4 Da（图2c-d）。这些结果都证明FnsA利用3和4为底物一步合成1。

图2 fnsA在酿酒酵母中表达产生柚皮素，喂养对香豆酸或对羟基苯甲酸后产量提高

（图源：Zhang H. et al., Nat Commun, 2022）

根据NRPS和PKS的合成机制，研究者推测FnsA的腺苷酰化结构域负责识别活化底物3和4为acyl-O-AMP，随后共价结合到硫醇化结构域上形成酰基硫酯；接着FnsA^PKS引入丙二酰辅酶A进行链延伸。为了验证该猜想，研究者将fnsA^A-T和fnsA^PKS分别在酵母中进行单独表达和共表达，同时进行底物饲喂实验。结果表明只有fnsA^A-T 和fnsA^PKS共同表达时才能产生1（图3b）,这证明fnsAA-T对于底物的活化是必需的。为了进一步确证该猜想，研究者进行了FnsA的体外酶促反应，结果从酶促反应产物中检测到分子量为494.1072和468.0917的两个产物3-AMP（6）and 4-AMP（7）的生成（图3d），该结果表明FnsA腺苷酰化结构域识别并活化底物为腺苷酸，随后以硫酯的形式锚定到FnsA硫醇化结构域，接着转移到FnsAPKS部分完成柚皮素的合成。

图3 FnsA^A-T，FnsA^PKS部分对于柚皮素的合成必不可少

（图源：Zhang H. et al., Nat Commun, 2022）

为进一步研究FnsA腺苷酰化结构域的功能，研究者将FnsA^A-T蛋白（71.5 kDa）分别与底物3和4进行体外酶促反应，反应10小时后的产物经SDS-PAGE后，切下介于70~80 kDa间的蛋白条带进行胰蛋白酶过夜酶解，得到144~4944 Da的肽段混合物用于LC-MS/MS分析。LC-MS/MS结果显示，FnsA^A-T与3反应后，目标肽段YADESFSHLGLTSMAGVVLR的Ser607分子量增加486.1220 Da；FnsA^A-T与4反应后，目标肽段YADESFSHLGLTSMAGVVLR的Ser607分子量增加444.1115 Da（由于Met608被氧化，故比预期值减少15.9955 Da）（图4）。这些结果证实了FnsA腺苷酰化结构域负责3或4的腺苷化和硫酯化，然后共价结合到FnsA硫醇化结构域的磷酸泛酰巯基乙胺的硫醇上。

图4 FnsA腺苷酰化结构域的功能表征

（图源：Zhang H. et al., Nat Commun, 2022）

CHS是植物中用于合成柚皮素的III型PKS，CHS使用辅酶A形式的单元作为底物合成柚皮素。然而，真菌NRPS-PKS杂合酶FnsA催化游离芳基酸(p-CA或p-HBA)直接产生柚皮素。这种差异引起了研究者对于FnsA聚酮部分的好奇。因此，研究者对FnsA的KS结构域进行了系统发育分析（图5a）。结果显示，FnsA聚酮部分是I型PKS，并与同源的KS结构域属于一个独立的分支，说明FnsA是一种新的柚皮素合酶。综上所述，研究者提出了P. fici中柚皮素的生物合成途径。p-CA（3）和p-HBA（4）作为起始单元，被FnsA的腺苷酰化结构域识别，然后以硫酯形式锚定在相邻的硫醇化结构域上。活化后的3或4随后分别被FnsA的KS结构域用3个或4个丙二酰辅酶A单元进行链的延伸。然后，柚皮素查尔酮经克莱森缩合反应自发或TE结构域介导产物释放。最后通过查尔酮异构酶CHI或自发非酶促反应将柚皮素查尔酮转化为柚皮素（图5b）。

确定了FnsA的功能后，研究者将底物3和4的生物合成途径工程到含有FnsA的酵母中，通过优化柚皮素的生产，获得摇瓶产量为30.2 mg·L^-1的柚皮素工程酵母菌株（QL35-NAR）。随后以QL35-NAR为底盘菌，重构并从头合成了植物黄酮异鼠李素（8）和金合欢素（9），经发酵条件优化，异鼠李素和金合欢素的产量分别为3.1 mg·L⁻¹和10.4 mg·L⁻¹（图6）。

图5 作为一个新的柚皮素合酶，FnsA合成柚皮素的途径及机制

（图源：Zhang H. et al., Nat Commun, 2022）

图6 利用FnsA在酵母中从头合成植物黄酮异鼠李素和金合欢素

（图源：Zhang H. et al., Nat Commun, 2022）

文章结论与讨论，启发与展望

综上所述，研究者挖掘并鉴定了一个新的NRPS-PKS杂合酶FnsA，FnsA作为一个新的柚皮素合酶，不同于植物细菌中由III型PKS催化多步合成柚皮素的合成途径，FnsA能以游离酸（对香豆酸或对羟基苯甲酸）为底物直接合成柚皮素，FnsA的发现改变了研究者对于柚皮素合酶的固有认识。同时工程fnsA从头合成植物黄酮，为微生物高效生产植物黄酮类化合物提供新策略。

原文链接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-34150-7

通讯作者：尹文兵

（照片提供自：尹文兵团队）

通讯作者简介（上下滑动阅读） 

尹文兵，博士，中国科学院微生物研究所研究员，担任国家卫健委重大新药创制项目、国家科技部重点研发计划专项、国家自然科学基金委通讯及会评专家，从事真菌天然产物合成生物学研究，从真菌中发现活性分子及调控元件，进行生物合成途径重建及新的代谢途径设计，用化学语言诠释真菌合成次级代谢产物过程中涉及到的生物学问题。以通讯作者身份在Nature Communications、Science advances、Journal of the American Chemical Society、Chemical Science、Natural product reports、Organic Letters等期刊发表100多篇论文。

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参考文献（上下滑动阅读）

[1] Zhao, Q. et al. A specialized flavone biosynthetic pathway has evolved in the medicinal plant, Scutellaria baicalensis. Sci. Adv. 2, e1501780 (2016).

[2] Álvarez‑Álvarez, R. et al. Molecular genetics of naringenin biosynthesis, a typical plant secondary metabolite produced by Streptomyces clavuligerus. Microb. Cell. Fact. 14, 178 (2015).

[3] Yang, Q. et al. The disruption of the MAPKK gene triggering the synthesis of flavonoids in endophytic fungus Phomopsis liquidambaris. Biotechnol. Lett. 43, 119-132 (2021).

[4] Lu, Y. et al. Potential application of CHS and 4CL genes from grape endophytic fungus in production of naringenin and resveratrol and the improvement of polyphenol profiles and flavour of wine. Food. Chem. 347, 128972 (2021).

本文完