J Cell Physiol︱华进联团队建立不同细胞来源的猪iPSCs诱导体系并探讨其差异

撰文︱于  帅，华进联责编︱王思珍，方以一编辑︱王如华

诱导多能干细胞（induced pluripotent stem cells，iPSCs）是由Oct4，Sox2，Klf4和c-Myc（OSKM）作为特定的转录因子感染小鼠成纤维细胞（mouse embryo fibroblasts，MEFs）最终得到的一种多能性干细胞[1]。和胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）相比，iPSCs的供体细胞广泛，同时避免了免疫排斥和伦理问题，因此，在细胞治疗和组织再生等临床应用方面更加具有优势。由于器官大小、生理学、解剖学和遗传的相似性，猪作为一种特殊的哺乳动物模型，可用作异种器官移植供体和动物疾病模型，在人类再生医学中发挥着至关重要的作用。而目前报道的猪iPSCs（piPSCs）诱导效率较低，且重编程时间长，难以应用在生产中[2-4]。因此建立一种效率高且时间短的重编程体系至关重要。

睾丸支持细胞（Sertoli Cells，SCs）是睾丸发育过程中出现最早的一类体细胞，可分泌多种功能因子，如AMH、BMP4和Activin A等，这些因子在重编程过程中可发挥促进作用[5-8]。同时，相比于其他体细胞而言，猪SCs更易分离获得，且成本较低，因此是一个非常完美的细胞模型。然而，猪SCs是否可实现重编程，以及最终得到的piPSCs与已有的piPSCs是否存在差异尚未可知。

2022年10月26日，西北农林科技大学动物医学院、陕西省干细胞工程技术中心华进联教授团队在Journal of Cellular Physiology上发表了题为“Comparative analysis of porcine iPSCs derived from Sertoli cells and fibroblasts”的研究论文。该研究以SCs为新的起始细胞，探究其重编程过程，并筛选过程中所需的转录因子组合（OCT4和c-MYC），同时将其与PEFs来源的piPSCs进行对比，发现WNT信号通路是最重要的信号通路。这些结果揭示了SCs可作为更好的起始细胞，具有极大的应用前景。

作者首先从1-2周龄猪睾丸中分离得到睾丸支持细胞（SCs），并利用qRT-PCR、免疫荧光技术证实其纯度可达90%。随后作者尝试利用SCs和猪胚胎成纤维细胞（PEFs）作为起始细胞，将本实验室构建的猪源OSKM因子导入二者进行重编程（图1a）。以碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，AP）作为多能性检测的指标。结果发现，SCs培养第3 d即出现隆起的克隆样细胞团，在培养第7 d时克隆长大且呈现AP阳性，随后挑取单克隆置于饲养层细胞铺的48孔中，进行培养（图1b）。但是PEFs培养至7d时尚无明显形态变化（图1b）。AP结果显示，SCs组最终形成克隆的效率显著高于PEFs组（图1c）。而将SCs和PEFs来源的piPSCs在形态上进行对比，发现二者均呈现圆形隆起态，均为AP阳性（图1d）。随后对SCs来源的克隆进行鉴定。免疫荧光结果表明，S-piPSCs可表达OCT4，SOX2，SALL4和LIN28A（图1e），但是不表达NANOG，REX1和TBX3等naïve态多能因子。同时，EB悬浮试验表明S-piPSCs可以形成EB球，且贴壁后可正常向三胚层分化，并表达AFP，TUBB3和DESMIN等三胚层分子标记（图1f, g）。

图1 PEFs和SCs重编程过程及S-piPSCs多能性与分化能力鉴定

（图源：Yu, et al., J Cell Physiol, 2022）

随后，对SCs与P-piPSCs进行多能基因的检测。结果表明，与SCs相比，在S-piPSCs中endo-OCT4、endo-SOX2、LIN28A、ETV5和SALL4等的表达量显著升高。与PEFs相比，在P-piPSCs中endo-OCT4、endo-SOX2、LIN28A、ETV5和SALL4等的表达量也显著升高（图2a）。而将S-piPSCs和P-piPSCs相比较，其中差异较大的是LIN28A和SALL4。与P-piPSCs相比，在S-piPSCs中endo-OCT4、和ETV5的表达量显著上调，而LIN28A和SALL4的表达量显著下调，endo-SOX2的表达量差异不大（图2a）。随后转录组分析表明，二者差异不大。利用S-piPSCs中下调基因进行KEGG途径富集分析表明，富集的KEGG途径包括TGF-β、Pluripotency of stem cells和代谢等信号通路（图2d）。利用S-piPSCs中上调基因进行KEGG途径富集分析表明，富集的KEGG途径包括PI3K-Akt、ECM、NFκB和TNF信号通路（图2e）。进一步对S-piPSCs的培养体系进行探究。结果发现，S-piPSCs可不依赖于SB431542的添加（图2f），这些结果表明S-piPSCs已被成功构建且可维持多能性，且与P-piPSCs主要差别在于TGF-β信号通路。

图2 PEFs和SCs来源的piPSCs转录组分析及培养体系鉴定

（图源：Yu, et al., J Cell Physiol, 2022）

作者发现，SCs诱导过程中挑取的单克隆存在AP阴性的情况，对其多能基因表达进行检测，发现OCT4未表达，因此作者推测OCT4可能是维持AP阳性的关键因素（图3a, b）。随后以SCs诱导体系为基础，作者尝试探究不同转录因子组合对重编程的作用。结果发现，只有同时存在OCT4和c-MYC时，才会出现AP阳性的克隆，且效率高于不同时含有这两者的转录因子组合（图3c-f）。为了进一步验证这一结果，作者构建了同时表达OCT4和c-MYC的载体进行重编程，获得了AP阳性的S-piPSCs（图3g, h）。这些结果表明OCT4是维持多能性的必要因素。

图3 SCs重编程过程中多种转录因子组合的鉴定

（图源：Yu, et al., J Cell Physiol, 2022）

此外，作者也对SCs来源的piPSCs向原始生殖细胞诱导进行了一些工作，间接实现了从睾丸来源的体细胞向生殖细胞诱导的目的。

文章结论与讨论，启发与展望综上所述，本研究建立了一种更高效的piPSCs重编程体系，并分析了关键的转录因子。piPSCs的起始来源细胞类型显著影响了重编程过程。睾丸支持细胞（SCs）可在7 d获得S-piPSCs，相比PEFs显著缩短了重编程时间，并显著提高了重编程效率。OCT4是重编程获得AP阳性克隆的核心转录因子，c-MYC可作为提高重编程效率的因子，二者可作为猪SCs成功诱导重编程最少的转录因子组合。然而目前仍在存在一些问题：目前PEFs和SCs为起始细胞得到的piPSCs不表达Nanog等多能基因，表明仍处于primed态，这在一定程度上限制了piPSCs的应用，难以更好地应用到生产与临床应用中。研究人员拟在SCs诱导培养体系的基础上，建立健全猪多能基因调控网络，最终优化piPSCs的诱导培养体系，希望可为piPSCs在家畜繁育和人类再生医学等研究上的应用提供巨大动力。

原文链接：https://doi.org/10.1002/jcp.30903

该论文通讯作者是西北农林科技大学动物医学院、陕西省干细胞工程技术中心华进联教授和李娜博士，于帅博士为该工作的第一作者。该课题得到了国家重点研发计划（2021YFD1200301），国家自然科学基金项目（32072806，32100638），陕西省科技创新团队项目（(2019TD‐036）和陕西省科技计划（2022NY‐044）的支持。

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本文完